Молекулярни методи за диагностика на бактериалните менингити

И. Симеоновски, В. Левтерова, Л. Бизева, Д. Нашев, Д. Мерджанов, проф. Т. Кантарджиев

НЦЗПБ – София

Менингитът представлява възпаление на обвивките на главния и гръбначния мозък, характеризиращо се с плеоцитоза в цереброспиналната течност и симптоми на менигеално дразнене [1].

Много са защитните фактори, които предпазват централната нервна система (ЦНС) от бактериални инфекции. Тесните връзки между клетките на церебралните съдове са естествена бариера за патогените, проникнали в кръвта. Независимо от това понякога бактериите преодоляват или заобикалят тези бариери, причинявайки инфекции на ЦНС. Обикновено това става по три пътя:

1) пенетрация като резултат от травма или хирургична намеса;

2) миграция от съседна инфекция или колонизация;

3) хематогенно проникване от друга, често отдалечена локация.

Остър менингит

Острият, развиващ се в рамките на 24 часа менингит се причинява обикновено от пиогенни бактерии. Етиологията зависи от това дали е вследствие на вътреболнична инфекция, или е придобит в обществото, като възрастта и общото състояние на пациента са от особено значение.

Бактериалните менингити са най-опасни в детска възраст, особено за новородени и кърмачета. Най-чести причинители на бактериален менингит са N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae серотип b.

Новородените и съвсем малките кърмачета най-често са атакувани от менингокок. Малко известно е, че доста от здравите хора са носители на тази бактерия. Повечето от носителите не боледуват или преминават през по-леки болести на горните дихателни пътища. Още не е установена причината, поради която при някои деца менингококът предизвиква свръхостър менингококов сепсис. Като най-вероятна се сочи неукрепналата имунна система. При остър менингит се засягат и сърдечно-съдовата система, надбъбречните жлези, появяват се хеморагични обриви, кръвното налягане спада критично.

Най-разпространен като етиология при възрастните е S. pneumoniae, като много често е налична бактериемия. Пациенти със спленектомия или намалена функция на далака могат да развият тежък сепсис, често включващ менингит, причиняван най-често от инкапсулирани бактерии.

Вследствие на ваксинационната политика острият бактериален менингит при деца, причинен от H. influenzae серотип b, е много рядко срещан и може да се наблюдава при възрастните в страните, където от години се прилага ваксина. Пациенти с дефицит на комплемента са податливи най-често на инфекции, причинени от N. meningitidis, докато при тези с травма на главата и нарушена dura mater менингитът се дължи най-вече на S. pneumoniae. Грам-отрицателните бактерии са най-чест причинител при неутропения или черепномозъчна хирургия. При новородени, имунокомпрометирани или в напреднала възраст пациенти менингитът често се причинява от L. monocytogenes [2].

Обикновено бактериите достигат менингите чрез бактериемия с начало от мукозни области. Случайно могат да проникнат и директно чрез травма, хирургична намеса или инвазивна медицинска процедура като лумбална пункция [1, 2]. Най-честите причинители на остър бактериален менингит според факторите на предиспозиция са представени на табл. 1.

Таблица 1. Най-чести причинители на остър бактериален менингит и фактори на предиспозиция

В България за периода 2006-2012 г. относителния дял на докладваните причинители на бактериален менингит е: Streptococcus pneumoniae – 38.33%, Neisseria meningitidis – 19.86%, Haemophilus influenzae – 8.58%, други видове стрепкококи (вкл. S. agalactiae) – 10.27, и други бактериални причинители – 32.96% [3]. Прави впечатление високият брой бактериални менингити с неизяснена етиология – например от около 250 докладвани годишно случая на бактериален менингит през 2005-2007 г. половината са с неизяснена етиология [4, 5].

Клинична картина

Класическите симптоми на острия менингит включват повишена температура, главоболие, менингизъм и нарушения в съзнанието. Не всички пациенти демонстрират класическата триада от треска, вратна ригидност и промяна в менталния статус, но почти всички имат поне един от тези симптоми [1, 2]. При възрастни отсъствието на тези три признака отхвърля диагнозата бактериален менингит в 99% от случаите.

При новородени, пациенти в напреднала възраст и такива с черепни травми могат да не се наблюдават класическите клинични симптоми. Обривът не е типичен признак при бактериален менигит, но наличието може да означава менингококова инфекция. Възможно е в началото да бъде еритематозен и макуларен, но бързо да премине в петехиален. Често развитието на картината на менингит се предхожда от симптоми на горна респираторна инфекция [1, 2].

Лабораторна диагностика

Типичните ликворни промени при бактериалния менингит са добре известни – ликворна плеоцитоза (2000-3000 и повече клетки/mm3), увеличен белтък и понижено съдържание на глюкоза [1].

Етиологичната диагноза се поставя чрез микробиологично изследване. Изолирането на патогена от ликвор, кръв и/или кожна биопсия от петехиални лезии и полимеразната верижна реакция (PCR) се приемат за „златен” стандарт в диагностиката, като културата е по-ниско чувствителна от PCR.

Хемокултурите, които са позитивни при 50-60% от случаите с менингит, винаги са показателни. Препаратът по Грам е положителен при 60-90% от пациентите и показва количество на бактериите над 10⁵ клетки/ml. При по-малко количество на бактериите чувствителността на препарата по Грам спада на около 25% [2]. При негативни култури и препарат по Грам латекс-аглутинационните тестове за бактериални патогени са високоспецифични, но чувствителността им е сравнително ниска – между 50 и 80%.

Генетичните методи за детекция на бактериална ДНК като PCR се отличават с висока специфичност и чувствителност при диагностиката на менингитите, особено в случаите на вече започнала антибиотична терапия [1, 6].

Острият бактериален менингит е състояние, което изисква бързи и адекватни мерки и бързата диагноза е от решаващо значение за терапията на пациента, както и относно мерките за профилактика на контактните. Резултатите от оценката на препарат от Грам приблизително могат да бъдат готови за 15-20 min, от детекцията на антиген с латекс-аглутинационен кит – за 30 min, от PCR – за 2.5-6 часа, и от посявката – от 16 часа до няколко дни. Разбира се, следва да се отчита и времето за транспорт на материала до лабораторията, изпълняваща съответното изследване [6].

Бързината и високата чувствителност са основни предимства на генетичните методи. Предимство е, че чрез PCR етиологичната диагноза може да се постави и след започване на антибиотичната терапия, която в повечето случаи е вече налице при вземането на материала за микробиологично изследване. Поради възможност за фалшиво позитивни и неспецифични резултати данните от тях трябва да се интерпретират винаги в корелация с другите параклинични и клинични находки [1].

В статията се разглеждат честите нетуберкулозни менингити, които не са след травма или хирургична интервенция.

Целта е представяне на нови методи за бърза диагностика чрез амплификация на ДНК.

Материали и методи

От края на 2012 г. НЦЗПБ и Българската асоциация на микробиолозите (БАМ) стартираха програма за бърза диагностика на най-честите бактериални менингити чрез PCR за установяване най-честите бактериални причинители на остър бактериален менингит – N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae с мултиплекс PCR и определяне на най-честите серотипове N. meningitidis.

От началото на годината към настоящия момент диагностиката се реализира и с полимеразно-верижна реакция в реално време (Real time PCR).

При получаване на ликвор или хемокултура от пациент с клинични и лабораторни данни за остър бактериален менингит лабораториите в страната имат възможност да изпратят чрез куриерска фирма материала за генетичен тест – PCR, в НЦЗПБ. При положителен резултат за N. meningitidis се продължава с установяване на серогрупата чрез PCR. На по-късен етап се предвижда и установяване на серотиповете на S. pneumoniae и H. influenzae с генетични методи, детекция на гени за резистентност и генетично типиране.

При изолиране на бактериалния причинител в болничната лаборатория изолатът се изпраща в НЦЗПБ за по-нататъшно типиране. По този начин може да се сравни чувствителността на генетичните и културелните методи.

Бързата РСR диагностика на преобладаващите инвазивни бактериални причинители, причинени от N. meningitidis, S. pneumoniae, H. Influenzae, се извършва в следната последователност:

1. Изолиране на ДНК от ликвор.
2. Получената ДНК се изследва чрез полимеразна верижна реакция в реално време за наличие на ДНК на N. meningitidis, S. pneumoniae, H. Influenzae, като изследването се извършва с помощта на праймери и сонди, ориентирани към целеви гени съответно: CTRA, sodC (N. meningitidis), hpd (Н. influenzae) и litA (S. pneumoniae) [7].
3. Изследването се провежда на апарати на фирмата Roche (LightCycler® 480) и фирмата Termo (PicoReal).

Следва типиране на открития причинител:

1. Молекулярно типиране на N. meningitidis чрез амплификация на специфични гени за серогрупи А, B, C ,W-135,Y с PCR с праймери за PCR с таргет orf-2 от гена minB за серогрупа А и гена siaD за серогрупа B, C, Y, W135 [8].
2. PCR се извършва с термосайклер на фирма Apllied Biosystems (Veriti 96 well thermal cycler).
3. Резултатите се визуализират на UV трансилюминатор.
4. Анализът на резултатите от PCR след завършването му се базира на присъствие или отсъствие на специфични бандове от амплифицираната ДНК, като пробите се нанасят на 2%^-на агарозна гел електрофореза.

До момента от началото на тази програма за PCR диагностика на най-честите бактериални менингити са изследвани 64 ликвора с находка, суспектна за бактериална етиология.

След изследване на получените ликвори с PCR и типиране на щамовете бяха събрани данни за 33 бактериални менингита при пациенти на възраст от 2 месеца до 83 години.

При изследването са потвърдени чрез PCR 13 положителни N. meningitits, 19 положителни за S. pneumoniae и 1 за H. influenzae

Останалите 31 клинични материала са отрицателни за N. meningitides, S. pneumoniae и H. influenzae, т.е. с вероятно други етиологични причинители, като някои от тях са съхранявани неправилно до провеждане на анализите.

На фиг. 1 е показан резултатът от проведен Real-Time PCR при доказване на ДНК за (litA)гена за наличие на S. pneumoniae във FAM канала.

            Фиг. 1

 Преимуществата на PCR в реално време са:

– Амплификацията се наблюдава в реално време. При него е по-висока чувствителността.

– Има минимален риск от контаминация.

– Детекцията е възможна дори и при значително по-ниска концентрация на ДНК.

– Позволява потвърждаване на специфична амплификация посредством анализ на кривата на топене.

– Не е особено по-скъп от обикновения PCR.

С развитието на молекулярните методи диагностиката става все по-бърза и по-точна.

Библиография

1. Tunkel et al. Acute bacterial meningiis. – In: Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th еd., 2009.
2. Hirshmann, J. Bacterial infections of the central nervous system. – In: Infectious Diseases: The Clinician’s Guide to Diagnosis, Treatment, and Prevention. David, C. Dale (Ed.), 2003.
3. Кожухарова, М. и др. Менингококови инфекции – епидемиологично значение и възможности за профилактичен контрол. – Topmedica, 2013, 10-13.
4. Информационен журнал на НЦЗПБ, 2008, N 4-5.
5. Информационен журнал на НЦЗПБ, 2008, N 6.
6. ECDC. Public health management of sporadic cases of invasive meningococcal disease and their contacts. Stockholm, ECDC, 2010.
7. Mothershed, E. A. et al. Use of real-time PCR to resolve slide agglutination discrepancies in serogroup identification of Neisseria meningitidis. – J. Clin. Microbiol., 42, 2004, 320-328.
8. Taha, Muhamed-Kheir et al. Interlaboratory comparison of PCR-based identification and genogrouping of Neisseria meningitidis. – J. Clin. Microbiol., 43, 2005, N 1, 144–149.