Молекулярни методи за диагностика на бактериалните менингити
И. Симеоновски, В. Левтерова, Л. Бизева, Д. Нашев, Д. Мерджанов, проф. Т. Кантарджиев
НЦЗПБ – София
Менингитът представлява възпаление на обвивките на главния и гръбначния мозък, характеризиращо се с плеоцитоза в цереброспиналната течност и симптоми на менигеално дразнене [1].
Много са защитните фактори, които предпазват централната нервна система (ЦНС) от бактериални инфекции. Тесните връзки между клетките на церебралните съдове са естествена бариера за патогените, проникнали в кръвта. Независимо от това понякога бактериите преодоляват или заобикалят тези бариери, причинявайки инфекции на ЦНС. Обикновено това става по три пътя:
1) пенетрация като резултат от травма или хирургична намеса;
2) миграция от съседна инфекция или колонизация;
3) хематогенно проникване от друга, често отдалечена локация.
Остър менингит
Острият, развиващ се в рамките на 24 часа менингит се причинява обикновено от пиогенни бактерии. Етиологията зависи от това дали е вследствие на вътреболнична инфекция, или е придобит в обществото, като възрастта и общото състояние на пациента са от особено значение.
Бактериалните менингити са най-опасни в детска възраст, особено за новородени и кърмачета. Най-чести причинители на бактериален менингит са N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae серотип b.
Новородените и съвсем малките кърмачета най-често са атакувани от менингокок. Малко известно е, че доста от здравите хора са носители на тази бактерия. Повечето от носителите не боледуват или преминават през по-леки болести на горните дихателни пътища. Още не е установена причината, поради която при някои деца менингококът предизвиква свръхостър менингококов сепсис. Като най-вероятна се сочи неукрепналата имунна система. При остър менингит се засягат и сърдечно-съдовата система, надбъбречните жлези, появяват се хеморагични обриви, кръвното налягане спада критично.
Най-разпространен като етиология при възрастните е S. pneumoniae, като много често е налична бактериемия. Пациенти със спленектомия или намалена функция на далака могат да развият тежък сепсис, често включващ менингит, причиняван най-често от инкапсулирани бактерии.
Вследствие на ваксинационната политика острият бактериален менингит при деца, причинен от H. influenzae серотип b, е много рядко срещан и може да се наблюдава при възрастните в страните, където от години се прилага ваксина. Пациенти с дефицит на комплемента са податливи най-често на инфекции, причинени от N. meningitidis, докато при тези с травма на главата и нарушена dura mater менингитът се дължи най-вече на S. pneumoniae. Грам-отрицателните бактерии са най-чест причинител при неутропения или черепномозъчна хирургия. При новородени, имунокомпрометирани или в напреднала възраст пациенти менингитът често се причинява от L. monocytogenes [2].
Обикновено бактериите достигат менингите чрез бактериемия с начало от мукозни области. Случайно могат да проникнат и директно чрез травма, хирургична намеса или инвазивна медицинска процедура като лумбална пункция [1, 2]. Най-честите причинители на остър бактериален менингит според факторите на предиспозиция са представени на табл. 1.
Таблица 1. Най-чести причинители на остър бактериален менингит и фактори на предиспозиция
| Фактор | Причинител |
| Възраст < 1 месец | Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Listeriamonocytogenes, Klebsiella species |
| 1-23 месеца | S. agalactiae, E. coli, Haemophilus influenzae,Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis |
| 2-50 години | S. pneumoniae, N. meningitidis |
| > 50 години | S. pneumoniae, N. meningitidis, L. monocytogenes,аеробни Грам-отрицателни бактерии |
| Имунен дефицит | S. pneumoniae, N. meningitidis, L. monocytogenes,аеробни Грам-отрицателни бактерии (вкл.Pseudomonas aeruginosa) |
| Базиларна черепна фрактура | S. pneumoniae, H. influenzae, S. pyogenes (gr A streptococci) |
| Травма, след неврохирургични операции | Staphylococcus aureus, coagulase-negativestaphylococci (особено Staphylococcus
epidermidis), аеробни Грам-отрицателни бактерии (вкл. Pseudomonas aeruginosa) |
В България за периода 2006-2012 г. относителния дял на докладваните причинители на бактериален менингит е: Streptococcus pneumoniae – 38.33%, Neisseria meningitidis – 19.86%, Haemophilus influenzae – 8.58%, други видове стрепкококи (вкл. S. agalactiae) – 10.27, и други бактериални причинители – 32.96% [3]. Прави впечатление високият брой бактериални менингити с неизяснена етиология – например от около 250 докладвани годишно случая на бактериален менингит през 2005-2007 г. половината са с неизяснена етиология [4, 5].
Клинична картина
Класическите симптоми на острия менингит включват повишена температура, главоболие, менингизъм и нарушения в съзнанието. Не всички пациенти демонстрират класическата триада от треска, вратна ригидност и промяна в менталния статус, но почти всички имат поне един от тези симптоми [1, 2]. При възрастни отсъствието на тези три признака отхвърля диагнозата бактериален менингит в 99% от случаите.
При новородени, пациенти в напреднала възраст и такива с черепни травми могат да не се наблюдават класическите клинични симптоми. Обривът не е типичен признак при бактериален менигит, но наличието може да означава менингококова инфекция. Възможно е в началото да бъде еритематозен и макуларен, но бързо да премине в петехиален. Често развитието на картината на менингит се предхожда от симптоми на горна респираторна инфекция [1, 2].
Лабораторна диагностика
Типичните ликворни промени при бактериалния менингит са добре известни – ликворна плеоцитоза (2000-3000 и повече клетки/mm3), увеличен белтък и понижено съдържание на глюкоза [1].
Етиологичната диагноза се поставя чрез микробиологично изследване. Изолирането на патогена от ликвор, кръв и/или кожна биопсия от петехиални лезии и полимеразната верижна реакция (PCR) се приемат за „златен” стандарт в диагностиката, като културата е по-ниско чувствителна от PCR.
Хемокултурите, които са позитивни при 50-60% от случаите с менингит, винаги са показателни. Препаратът по Грам е положителен при 60-90% от пациентите и показва количество на бактериите над 105 клетки/ml. При по-малко количество на бактериите чувствителността на препарата по Грам спада на около 25% [2]. При негативни култури и препарат по Грам латекс-аглутинационните тестове за бактериални патогени са високоспецифични, но чувствителността им е сравнително ниска – между 50 и 80%.
Генетичните методи за детекция на бактериална ДНК като PCR се отличават с висока специфичност и чувствителност при диагностиката на менингитите, особено в случаите на вече започнала антибиотична терапия [1, 6].
Острият бактериален менингит е състояние, което изисква бързи и адекватни мерки и бързата диагноза е от решаващо значение за терапията на пациента, както и относно мерките за профилактика на контактните. Резултатите от оценката на препарат от Грам приблизително могат да бъдат готови за 15-20 min, от детекцията на антиген с латекс-аглутинационен кит – за 30 min, от PCR – за 2.5-6 часа, и от посявката – от 16 часа до няколко дни. Разбира се, следва да се отчита и времето за транспорт на материала до лабораторията, изпълняваща съответното изследване [6].
Бързината и високата чувствителност са основни предимства на генетичните методи. Предимство е, че чрез PCR етиологичната диагноза може да се постави и след започване на антибиотичната терапия, която в повечето случаи е вече налице при вземането на материала за микробиологично изследване. Поради възможност за фалшиво позитивни и неспецифични резултати данните от тях трябва да се интерпретират винаги в корелация с другите параклинични и клинични находки [1].
В статията се разглеждат честите нетуберкулозни менингити, които не са след травма или хирургична интервенция.
Целта е представяне на нови методи за бърза диагностика чрез амплификация на ДНК.
Материали и методи
От края на 2012 г. НЦЗПБ и Българската асоциация на микробиолозите (БАМ) стартираха програма за бърза диагностика на най-честите бактериални менингити чрез PCR за установяване най-честите бактериални причинители на остър бактериален менингит – N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae с мултиплекс PCR и определяне на най-честите серотипове N. meningitidis.
От началото на годината към настоящия момент диагностиката се реализира и с полимеразно-верижна реакция в реално време (Real time PCR).
При получаване на ликвор или хемокултура от пациент с клинични и лабораторни данни за остър бактериален менингит лабораториите в страната имат възможност да изпратят чрез куриерска фирма материала за генетичен тест – PCR, в НЦЗПБ. При положителен резултат за N. meningitidis се продължава с установяване на серогрупата чрез PCR. На по-късен етап се предвижда и установяване на серотиповете на S. pneumoniae и H. influenzae с генетични методи, детекция на гени за резистентност и генетично типиране.
При изолиране на бактериалния причинител в болничната лаборатория изолатът се изпраща в НЦЗПБ за по-нататъшно типиране. По този начин може да се сравни чувствителността на генетичните и културелните методи.
Бързата РСR диагностика на преобладаващите инвазивни бактериални причинители, причинени от N. meningitidis, S. pneumoniae, H. Influenzae, се извършва в следната последователност:
- Изолиране на ДНК от ликвор.
- Получената ДНК се изследва чрез полимеразна верижна реакция в реално време за наличие на ДНК на N. meningitidis, S. pneumoniae, H. Influenzae, като изследването се извършва с помощта на праймери и сонди, ориентирани към целеви гени съответно: CTRA, sodC (N. meningitidis), hpd (Н. influenzae) и litA (S. pneumoniae) [7].
- Изследването се провежда на апарати на фирмата Roche (LightCycler® 480) и фирмата Termo (PicoReal).
Следва типиране на открития причинител:
- Молекулярно типиране на N. meningitidis чрез амплификация на специфични гени за серогрупи А, B, C ,W-135,Y с PCR с праймери за PCR с таргет orf-2 от гена minB за серогрупа А и гена siaD за серогрупа B, C, Y, W135 [8].
- PCR се извършва с термосайклер на фирма Apllied Biosystems (Veriti 96 well thermal cycler).
- Резултатите се визуализират на UV трансилюминатор.
- Анализът на резултатите от PCR след завършването му се базира на присъствие или отсъствие на специфични бандове от амплифицираната ДНК, като пробите се нанасят на 2%-на агарозна гел електрофореза.
До момента от началото на тази програма за PCR диагностика на най-честите бактериални менингити са изследвани 64 ликвора с находка, суспектна за бактериална етиология.
След изследване на получените ликвори с PCR и типиране на щамовете бяха събрани данни за 33 бактериални менингита при пациенти на възраст от 2 месеца до 83 години.
При изследването са потвърдени чрез PCR 13 положителни N. meningitits, 19 положителни за S. pneumoniae и 1 за H. influenzae
Останалите 31 клинични материала са отрицателни за N. meningitides, S. pneumoniae и H. influenzae, т.е. с вероятно други етиологични причинители, като някои от тях са съхранявани неправилно до провеждане на анализите.
На фиг. 1 е показан резултатът от проведен Real-Time PCR при доказване на ДНК за (litA)гена за наличие на S. pneumoniae във FAM канала.
Фиг. 1
Преимуществата на PCR в реално време са:
– Амплификацията се наблюдава в реално време. При него е по-висока чувствителността.
– Има минимален риск от контаминация.
– Детекцията е възможна дори и при значително по-ниска концентрация на ДНК.
– Позволява потвърждаване на специфична амплификация посредством анализ на кривата на топене.
– Не е особено по-скъп от обикновения PCR.
С развитието на молекулярните методи диагностиката става все по-бърза и по-точна.
Библиография
- Tunkel et al. Acute bacterial meningiis. – In: Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th еd., 2009.
- Hirshmann, J. Bacterial infections of the central nervous system. – In: Infectious Diseases: The Clinician’s Guide to Diagnosis, Treatment, and Prevention. David, C. Dale (Ed.), 2003.
- Кожухарова, М. и др. Менингококови инфекции – епидемиологично значение и възможности за профилактичен контрол. – Topmedica, 2013, 10-13.
- Информационен журнал на НЦЗПБ, 2008, N 4-5.
- Информационен журнал на НЦЗПБ, 2008, N 6.
- ECDC. Public health management of sporadic cases of invasive meningococcal disease and their contacts. Stockholm, ECDC, 2010.
- Mothershed, E. A. et al. Use of real-time PCR to resolve slide agglutination discrepancies in serogroup identification of Neisseria meningitidis. – J. Clin. Microbiol., 42, 2004, 320-328.
- Taha, Muhamed-Kheir et al. Interlaboratory comparison of PCR-based identification and genogrouping of Neisseria meningitidis. – J. Clin. Microbiol., 43, 2005, N 1, 144–149.
N/A: Национална научна конференция по детска неврология, психиатрия и психология на развитието