Химеризъм и неговото приложение за мониториране на пациенти след алогенна трансплантация на хемопоетични стволови клетки

Цв. Луканов, М. Иванова-Шиварова, Ел. Наумова

Клиника по клинична имунология с банка за стволови клетки, УМБАЛ „Александровска“, София

Терминът „химеризъм“ произлиза от Химера – митологично същество от Древна Гърция с глава на лъв, тяло на коза и опашка на влечуго. Съвременната употреба на термина „химеризъм“ в трансплантологията произтича от идеята за съвместно съществуване у трансплантирания на клетки от два генетично различни индивида. Извън сферата на трансплантацията генетично чужди клетки, но в много по-малко количество – т. нар. микрохимеризъм, може да се наблюдават при раждали жени или при кръвопреливания. При бременност трансферът на клетки е двупосочен – от майката към плода и обратно. Тези микрохимерни клетки може да се запазят и да се наблюдават в кръвта на майката/детето десетки години след раждането.

Въпреки че са разработени редица методи за определяне на химеризъм, най-широко застъпен е PCR-STR методът. Той е базиран на амплификация на микросателити (къси тандемни копия – short tandem repeats, STR), като е разработен за нуждите на криминалистиката, но успешно се прилага и в медицината.

STR локусите представляват повтарящи се къси (2-7 базови двойки – base pairs, bp) некодиращи последователности от ДНК, които се срещат често в генома (приблизително на всеки 10 000 bp) и се откриват върху всички хромозоми [1]. Те са предпочитан маркер при този вид генетична идентификация, тъй като са лесни за амплификация, позволяват използването на мултиплексни протоколи, силно полиморфни са и са с висока дискриминативна способност. Скоростта на мутация на микросателитите е 10^-2-10^-6 събития на локус на поколение – тоест от 100 до 1000 пъти по-бърза от мутацията при останалата ядрена ДНК [2]. Именно възможността за разграничаване на генетично различни индивиди ги прави особено подходящи в криминалистиката – при използване на 18 STR локуса шансът за откриване на друг идентичен човек е 1х10^-30. Методът има широко приложение при:

• определяне на бащинство/майчинство;
• определяне на генетична идентичност при други видове;
• идентификация и характеризиране на проби – проучване на родословие, автентикация на клетъчни линии, биобанкиране, изследване на генетични заболявания, потвърждаване на идентичност на проби, тестване на произход на тъкани;
• идентификация на смесени проби – микрохимеризъм след бременност (майка ↔ дете), установяване на замърсяване при биобанкиране и работа с биопродукти, мониториране на пациенти след алогенна трансплантация на хемопоетични стволови клетки.

Алогенната трансплантация на хемопоетични стволови клетки (ТХСК) се осъществява чрез инфузия на стволови клетки от костен мозък, кръв от пъпна връв или периферна кръв (извлечени след предварителна стимулация с гранулоцит-колони стимулиращ фактор, G-CSF) от родствен или неродствен донор. Инфузията на стволови клетки се предшества от прилагането на режим на кондициониране (подготовка) на пациента чрез химиотерапия и/или лъчетерапия, предназначен за унищожаване на остатъчни злокачествени клетки и индуциране на имуносупресия, за да се улесни присаждането. Възстановяването на хемопоезата до голяма степен зависи от възможността донорните хемопоетични стволови клетки да генерират достатъчно прогениторни клетки, които да населят нишите на костния мозък. Създава се динамична донор-реципиент химера, чието проследяване – качествено или количествено, е важен компонент от следтрансплантационния мониторинг на пациентите [4]. Нивата на донорния химеризъм служат като индикатор за рецидив на болестта, отхвърляне на присадката, минимална резидуална болест (MRD) или реакция на присадката срещу гостоприемника (GvHD). Проследяването му подпомага свързаната с риска имунотерапия при профилактиката и интервенционалното лечение на GvHD или предстоящ рецидив. Установяването на персистиращи или новопоявили се клетки на реципиента предполага наличие на оцелели левкемични клетки, които да доведат до повторно възникване на малигнения клон. По тази причина точното определяне на нивата на химеризъм в кръвта или костния мозък на пациента предоставя критична информация за степента на заселване и спомага за по-адекватното лечение на реципиентите [5]. Първоначално се е смятало, че пълната донорна хематопоеза е от съществено значение за оцеляване на присадката след ТХСК, но през последните години стана ясно, че следтрансплантационният химеризъм е динамичен процес и пациенти с пълен химеризъм (донорни клетки >99%) в даден период след трансплантацията в друг период могат да развият смесен химеризъм, и обратното – пациенти със смесен могат да развият пълен химеризъм.

Важен фактор за очаквания профил на химеризъм е предтрансплантационното кондициониране на пациентите. Лечението с химио- или лъчетерапия води до тежко изчерпване на всички хемопоетични клетки на имунната система. Както алкилиращите химиотерапевтични средства, така и радиотерапията въздействат предимно на бързо пролифериращите клетки, включително зрели или наивни лимфоцити. Режимите за кондициониране водят до неутропения, която може да продължи до и над 30 дни, в зависимост от източника на стволови клетки. При тях се наблюдава бързо достигане до пълен донорен химеризъм. Забавеното възстановяване след миелоаблация е свързано с висока степен на заболеваемост и смъртност. Обратно – немиелоаблативното кондициониране и това с намален интензитет целят по-скоро имуносупресия, отколкото аблация. Поради тази причина продължителността на цитопенията е по-кратка и при тези пациенти е по-вероятно наличието на първоначален смесен химеризъм, което налага и по-честото му проследяване, за да може да се контролират последващи усложнения (рецидив или GvHD), както и с оглед на по-точното преценяване на необходимостта от инфузия на донорни лимфоцити (DLI). Лимфоидното възстановяване зависи от централните органи на имунната система, където се осъществява първичната пролиферация и диференциация на клетките – колкото по-млади са пациентите, толкова по-бързо се възстановяват CD4⁺ Т-клетките, В-клетките и NK-клетките. Възстановяването на NK-клетките след ТХСК зависи от експанзията на цитокин-продуциращата CD56^bright NK-клетъчна линия. Първоначалното възстановяване на Т-клетките зависи от пролиферацията на паметовите Т-клетки, която се управлява от цитокини, и наличието на алореактивни антигени. Интересното е, че CD8⁺ Т-клетките се възстановяват с подобни темпове при млади и възрастни пациенти, което може да се дължи на екстратимусна клонална експанзия. Възстановяването на В-клетките отнема най-дълго време (до 2 години) и е предшествано от увеличаване на преходните CD19⁺CD24⁺⁺CD38⁺⁺ В-клетки [6]. Освен това изчерпването на имунните клетки от предтрансплантационното кондициониране води до повишено стареене на хемопоетичната система, съчетано с повишаване на инхибиторите на циклин-зависимата киназа p19^Arf и p16^ink4A, имитирайки някои от свързаните с възрастта ефекти [7].

Ало-ТХСК е средство за дефинитивно излекуване при редица наследствени или придобити немалигнени заболявания. При този род трансплантации целта е да се постигне стабилно заселване на присадката, която да осигури необходимата хемопоетична функция, ензимна активност или имунокомпетентност. Също така при пациентите с немалигнени заболявания не се търси анти-левкемичен/туморен ефект на самата трансплантация. Поради тази причина постигането на пълна донорна химера не е задължително и съответно – подготовката на реципиента обичайно се извършва с немиелоаблативна терапия. Това води до по-честото наличие на смесен химеризъм и увеличава риска от отхвърляне на присадката, но намалява вероятността от развитие на GvHD. Бързото развитие на пълен химеризъм в NK- и Т-клетките благоприятства успешното заселване на присадката, но повишава риска от развитие на остра GvHD. В някои случаи пациентите с години могат да поддържaт стабилен смесен химеризъм, без това да се отразява на клиничното им състояние. Наблюдават се значително по-големи колебания в нивата на CD3⁺ клетките, в сравнение с CD19⁺, което предполага CD3⁺ медииран отговор между клетките на донора и реципиента поради непълно премахване на клетките на реципиента при кондиционирането.

При пациентите със злокачествени заболявания е важно да се следят едновременно MRD и нивата на химеризъм. Минималната резидуална болест се мониторира чрез търсене със съответна PCR технология на маркери, известни от активното заболяване на пациента и в голяма степен показва риска от появата на рецидив. Наличието на смесен химеризъм в Т-лимфоцитите след 90-ия ден се свързва с повишен риск от прогресия на заболяването. Постигането на пълна донорна химера и липсата на МРБ се свързват с продължителна свободна от болест преживяемост. Конверсията от смесен към пълен донорен химеризъм предхожда или се асоциира с началото на GvHD [8].

Основна цел на следтрансплантационния мониторинг е ранната диагностика на нежелани събития. Поради динамичната природа на развитието на химеризма се предпочита изследването да се извършва на кратки интервали, особено в първите 1-2 месеца след трансплантация, когато рискът от рецидив или отхвърляне на присадката е най-голям. В България има утвърдена схема за проследяване нивата на химеризъм, която е включена в медицински стандарт „Имунологична подготовка при трансплантация на органи, тъкани и клетки (Наредба №18/01.08.2014 г.) – на две седмици до 2-рия месец, на 3-тия месец, на тримесечни интервали до 18-ия месец. В най-ранния следтрансплантационен период наличието на персистиращ смесен химеризъм или изчезването на донорни алели се асоциира както с отхвърляне на присадката, така и с ранен рецидив. От друга страна, нарастващият брой на клетки на реципиента в по-късните периоди след трансплантацията се асоциира отново с рецидив или късно отхвърляне на ало-трансплантата. Механизмите, които насочват възстановяването на хемопоезата в различни посоки – към смесена при едни пациенти или пълна донорна химера при други, все още не са напълно изяснени. Анализът на кинетиката на химеризма позволява ранна диференциация между липсата на прихващане на трансплантата и забавянето му, както и ранна диагностика на пациенти с висок риск от развитие на GvHD или предразположени към рецидив.

Библиография:

1. Lukanov, T., Shivarova-Ivanova, M., Naumova, E., Monitoring of Chimerism following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. In: Hematopoietic Stem Cells (ISBN 978-953-51-4937-8).
2. Wan, Q. H., Wu, H., Fujihara, T., Fang, S.G. Which genetic marker for which conservation genetics issue. Electrophoresis. 2004. 25(14):2165-2176.
3. Gratwohl, A., Baldomero, H., Gratwohl, M. et al. Quantitative and qualitative differences in use and trends of hematopoietic stem cell transplantation: a Global Observational Study. Haematologica. 2013. 98(8):1282-1290.
4. Луканов, Цв., Наумова, Е. Място на анализа на химеризъм при ТХСК. Медицински преглед. 2015. 51(1):15-19.
5. Lukanov, T., Shivarova-Ivanova, M., Naumova, E. Chimerism Analysis after Allogeneic Stem Cell Transplantation: Quantitative real-time or Short Tandem Repeat PCR. Compt. Rend. Acad. Bulg. Sci. 2015. 68(4):521-528.
6. Seggewiss, R., Einsele, H. Immune reconstitution after allogeneic transplantation and expanding options for immunomodulation: an update. Blood. 2010. 115(19):3861–3868.
7. Meng, A., Wang, Y., Van Zant, G., Zhou, D. Ionizing radiation and busulfan induce premature senescence in murine bone marrow hematopoietic cells. Cancer Res. 2003. 63(17):5414–5419.
8. Shaffer, B.C., Stetler-Stevenson, M., Arthur, D.C., Steinberg, S.M., Liewehr, D.J., Fowler, D.H. et al. Rapid complete donor lymphoid chimerism and graft-versus-leukemia effect are important in early control of chronic lymphocytic leukemia. Exp Hematol. 2013. 41(9):772-778.