Клетъчни терапии при трансплантация на хемопоетични стволови клетки

М. Йорданова, Д. Константинов

Клиника по детска клинична хематология и онкология, УМБАЛ „Царица Йоанна – ИСУЛ“

 

Приложението на ТХСК е рисково поради възможни усложнения на всеки етап от процедурата – странични действия на цитостатиците и/или от олъчването, имунен конфликт между донорните клетки и тъканите у пациента, инфекциозни усложнения в интервала до утвърждаване на нова компетентна имунна система. Въпреки че ТХСК е ефективна терапевтична алтернатива при неблагоприятно протичащи злокачествени заболявания, тя не предлага универсална защита срещу рецидиви.

През последното десетилетие перспективите за развитие и усъвършенстване на метода с цел постигане на по-висока ефективност и намаляване на усложненията са свързани изключително с клетъчната терапия. Тя се състои в преливане на концентрати от грижливо селектирани, със строго търсени характеристики, донорни имунокомпетентни клетки, в определени ситуации подложени на допълнителна обработка – активация, генна модулация (трансфекция) и др. Те могат да бъдат получени от конкретен донор за планираната трансплантация или от друг (т. нар. „страничен донор” – 3^rd part). Клетъчна терапия е възможна и с клетки от самия пациент (автоложни) след процес на генно модифициране и „преоборудване” с нови функции.

Клетъчните концентрати обикновено са предназначени за конкретен пациент и във връзка с настъпили клинични усложнения от трансплантацията (GvHD, инфекции) или поради рискове от активиране на изходното заболяване (рецидив). Изготвят се в самостоятелен производствен процес, подобно на самите трансплантати, при строго съблюдавани лабораторни условия (good manufacturing practice – GMP), стриктни административни регулации и проверки за качество и безопасност преди приложение в клинични условия.

Клетъчната терапия се основава на познаването на специфичните функции на различните имунокомпетентни клетки в процесите на туморно разпознаване, както и процесите на клетъчно разрушаване, имунна толерантност и противоинфекциозна защита.

 

Tерапии за дефинитивно унищожаване на остатъци от злокачествено заболяване и за намаляване на риска от рецидив

Въпреки успехите на трансплантацията при лечението на тежките форми на левкемия, все още значителна част от пациентите остават с много неблагоприятна крайна прогноза поради високия риск от рецидиви. При някои от тях неефективният контрол и прогресията на болестта понякога са ограничаващ фактор за достигане до етапа на трансплантацията като спасителна възможност.

Известно е, че прелетите с трансплантата цитотоксични NK-клетки (natural killer cells) осъществяват първата линия неспецифична лимфоцитна защита. Същите непосредствено, но краткосрочно, елиминират остатъчните злокачествени клетки. Наличието на разлики между донора и приемателя в експресията на характерен за NK-клетките рецептор (KIR), в контекста на комплекса на тъканна съвместимост (HLA class I) осигурява по-бърза и ефективна имунна атака.

 

Терапия с NK-клетки

Алогенни (донорни) NK-клетки за предпазване и лечение на рецидив могат да се прилагат както след хапло-ТХСК, така и при липса на предхождаща трансплантация. Предварително се прилага химиотерапия, която да осигури време на действие на прелетите клетки, преди да бъдат отхвърлени. NK-клетъчен материал се получава посредством левкаферези на донорен материал, подбиран по KIR-HLA несъответствията им с приемателя. Може да бъдат отделени и от кръв от пъпна връв. Тези клетки не предизвикват „болест на присадката” (GvHD).

В по-голямата част от актуалните клинични проучвания (към момента над 15) се изследва ефективността им срещу левкемични клетки (остра миелоидна левкемия), но е доказано действието им и срещу други туморни клетки – хепатоцелуларни, недребноклетъчни белодробни и назофарингеални карциноми. Предизвикателство е осигуряването и поддържането у приемателя на достатъчно висока концентрация на активирани NK. Това налага развитието на лабораторни техники за предварително in vitro размножаване (експандиране), активация и съхраняване чрез замразяване (криопрезервация) на отделените донорни клетки.

Основните клетки, осигуряващи специфична дългосрочна анти-туморна активност, са Т-лимфоцитите – собствени и донорни. Посредством своя Т-клетъчен рецептор (TCR) те могат да разпознават и атакуват специфични антигени върху злокачествените клетки (тумор-асоциирани антигени).

 

Донорни лимфоцитни инфузии – DLI

Донорната Т-клетъчна имунна реакция срещу левкемични или туморни клетки на приемателя/пациента се нарича ефект на „присадката срещу левкемията/тумора” (GVL/Т) и е търсен феномен при ТХСК за елиминиране на остатъчни злокачествени клетки. Интензивността на този ефект се повишава чрез допълнителни инфузии на донорни лимфоцити (DLI), обикновено след 3-тия месец от трансплантацията. Те също се добиват от периферната кръв на донора посредством левкафереза и се трансфузират на пациента в последователно нарастващи концентрации. Методът се прилага като профилактика и терапия на рецидиви, най-често на хронична и остра миелоидна левкемия (CML, AML). Преливането на цялостния набор от Т-клетъчни субпопулации обаче, може да се усложни с нежелана имунна атака срещу органи и тъкани у приемателя, да бъде компрометиран полезният ефект от терапията и да предизвика остра, високостепенна „болест на присадката” (III и IV степен GvHD) в 15-35% от случаите и смъртност в около 4-15%.

Възможностите за ограничаване на нежеланите странични действия на DLI са предмет на актуални клинични проучвания в посока:

• генетично модулиране на донорните лимфоцити – снабдяване със „суициден“ ген за отстраняването им in vivo при нужда;
• отстраняване на най-активните имунни ефекторни клетки, причиняващи GvHD, съхранявайки желаната реакция срещу туморни клетки;
• контрол на имунната реакция чрез увеличаване на естествените Т-регулаторни клетки (Treg).

За подсилване на противотуморния профилактичен ефект на DLI се въвеждат допълнително стимулирани ex vivo донорни Т-лимфоцити (активирани DLI). При настъпил рецидив се прилагат и добити в култури (експандирани) цитотоксични Т-лимфоцити (CTL) с доказана in vitro активност срещу бластите.

Сполучлив метод за интензивна и прецизно насочена имунната терапия е „преоборудването” на Т-лимфоцитите със строго специфичен антигенен рецептор.

 

CAR–T-клетки – Т-лимфоцити с генно-модифициран химерен антигенен рецептор (chimeric antigen receptors-engineered T cells)

Терапията на В-клетъчни неоплазми с 19CAR-T-клетки е един от най-любопитните и елегантни лечебни подходи, въведени през последните години и с регистриран сериозен успех при неподдаващи се на друго лечение левкемии и лимфоми у деца и възрастни. Химерният антигенен рецептор е изкуствена конструкция (получена в резултат на въведен чрез вирусен вектор ген в Т-лимфоцитите), която пренасочва имунната атака към клетки, експресиращи на повърхността си универсалния, специфичен за В-лимфоцитите антиген CD19. При осъществено свързване с целевата молекула на повърхността на бластната клетка се активира типичната за цитотоксичните Т-лифоцити вътреклетъчна каскада, която я унищожава. При инфузия на CAR-T-клетки и постигането на търсения имунен механизъм, настъпилото клетъчно разпадане е съпроводено с взривно освобождаване на значителни количества цитокини, което може да доведе до тежки системни токсични реакции („Синдром на цитокинно освобождаване“ – CRS), фиг. 1. Това налага клиничното състояние на пациентите да е обект на наблюдение и комплексно лечение в интензивно отделение, включително и приложение на интерлевкин-6 блокиращи антитела за патогенетично блокиране на процеса. На този етап подготовката на такава терапия е все още твърде сложна, защото изисква изработване на продукт за индивидуален пациент, подходяща е при ограничен брой пациенти и предполага сериозни разходи.

 

Copyright 2015, Novartis corporation

Фиг. 1. За да се приложат CAR-модифицирани T-клетки за лечение е необходимо:

1. Получаване на автоложни клетки от пациента чрез левкафереза и отделяне (селектиране) на Т-лимфоцитите. 2. In vitro активиране и генно модифициране на клетките за експресиране на рецептор (CAR), специфично реактивен към определен туморен антиген. 3. Размножаване на модифицираните Т-клетки. 4. Предварителна лимфо-редуктивна терапия за подпомагане на пролиферацията и задържането на CAR-T клетките у пациента. 5. Преливане на активираните клетки по схема.

 

 

Вирус-специфична клетъчна терапия след трансплантация

Рективацията или de novo развила се инфекция с латентни цитомегаловирус (CMV), Epstein-Barr (EBV) и аденовируси, както и инвазивните кандидозни и аспергилусни гъбичкови инфекции са сериозно усложнение, повлияващо крайния изход от трансплантацията. Въпреки профилактичното и терапевтично приложение на медикаменти, специфичните Т-клетки са единственото средство за ефективен траен контрол при имунокомпрометирани пациенти, каквито са трансплантираните. Трансферът на вирус-специфични паметови Т-клетки е в състояние да възстанови антивирусния имунитет след ТХСК, което е намерило потвърждение при наблюденията на терапията с DLI още през 90-те години на миналия век. Прелети лимфоцити от CMV-позитивни донори са контролирали успешно CMV-вирусни инфекции у пациенти именно поради наличието на активни Т-клетки. Реактивацията на EBV, причиняваща т. нар. „пост-трансплантационна масивна В-клетъчна лимофопролиферация (PTLD)”, също се лекува успешно с DLI. През последните 20 години адоптивната (привнесена) Т-клетъчна терапия се превърна в сериозна алтернатива на фармакологичното лечение при рефрактерни инфекции след ТХСК. Преливането на пълен коктейл от донорни лимфоцити има ограничения, свързани с потенциални странични ефекти. Съвременните стратегии имат за цел отстраняване (деплеция) на потенциалните алореактивни причинители на GvHD и увеличаване на концентрацията (селекция) на активните срещу вируса клетки. Това се осъществява чрез имуномагнитни системи в строго контролирани условия на сертифицирани за качество и безопасност лабораторно-производствени центрове (GMP лаборатории).

 

 

Клетъчни терапии за контрол на „болест на присадката – GvHD”

Съществените рискове от имунен конфликт между присадката и приемателя може да се преодолеят чрез три основни стратегии.

 

1. Избирателно преливане на отделни клетъчни популации. Селекция и деплеция на трансплантати.

Това са класически подходи за осъществяване на ТХСК при непълна съвместимост между донора и приемателя. Т-лимфоцитите са основната клетъчна популация, предизвикваща имунен конфликт, като целта при обработката на трансплантата е частичното или цялостно им елиминиране. Това се постига чрез имуномагнитни прийоми, при които избирателно се отделят само хемопоетичните стволови клетки (характеризирани с мембранен маркер CD34). Нарича се „позитивна CD34-селекция”.

Цялостното елиминиране на Т-лимфоцитите се обозначава като „пан-Т-деплеция”. Лишаването от Т-лимфоцити може да доведе до неудачи при „захващане на присадката” поради липсата на клетки, които потискат имунната бариера у приемателя. Възстановяването от такава трансплантация е свързано с рискове от опортюнистични инфекции поради много по-бавното и трудно възстановяване на клетъчния имунитет. Рисковете за рецидив на основното заболяване са значими, защото представители на същата Т-клетъчна популация осъществяват и GVL-ефекта. В опит за преодоляване на тези нежелани усложнения се прилагат по-сложните, специализирани и скъпи методи за клетъчно сепариране. Те осигуряват прецизно отделяне на Т-клетъчни субпопулации с различни функции – деплеция само на цитотоксичната CD8+ T-фракция, отделяне на Т- и на В-лимфоцитите (CD3/CD19 деплеция), отстраняване на основните реактивни клетки, предизвикващи GvHD (αβ T-/CD19 деплеция) и др.

 

2. Т-регулаторни клетки (TReg)

Това е субпопулация на Т-хелперните лимфоцити (CD4 pos T-cells), към която през последните години се проявява подчертан експериментален интерес поради факта, че играе основна роля в установяването на имунен толеранс към чужди антигени при трансплантация. Клинични проучвания показват ефективността на Treg в предотвратяването на острата форма на „болест на присадката”, във възстановяването на имунитета след трансплантация и в подобряването на устойчивостта на пациентите срещу опортюнистични инфекции. Treg могат да бъдат получени от донора за трансплантация, селектирани и размножени в клетъчна култура. Независим от донора източник на Treg може да бъде кръв от пъпна връв.

Установено е, че апликацията на ниски дози интерлевкин-2 може да потенцира in vivo ускорено размножаване на функционални Treg, подобрявайки хроничните форми на GvHD. Това би могло да се превърне в потенциална терапия на нарушения имунен баланс след ТХСК.

 

3. Мезенхимни стволови (стромални) клетки – MSC

Изолирани от костен мозък и описани за пръв път от Caplan и сътр. през 1991 г., тези мултипотентни клетки имат възможности за превръщане (диференциация) в мастна, хрущялна и остеогенна тъкан. Понастоящем се смята, че могат да възстановяват и трите герминативно-клетъчни линии. Освен тъканна регенерация, те са способни да модулират имунни и възпалителни реакции и да поддържат хемопоезата. MSC вече се изолират и от други източници – кръв от пъпна връв, мастна тъкан, мускули, дентална пулпа. Използват се за лечение при болест на Crohn, ревматоиден артрит, диабет и мултиплена склероза. Най-успешното им клинично приложение досега е в хематологията и по-специално при ТХСК. MSC подкрепят възстановяването на кръвотворенето и затова се преливат в случаи на неудачи със захващането на присадката или лошото й функциониране.

MSC контролират имунния конфликт при GVHD. След съобщение от белгийската група на Le Blanc и сътр. за спасено дете с тежък рефрактерен GVHD, мезенхимните клетки се прилагат в различни проучвания както за профилактика, така и за лечение при „болест на присадката”, нечувствителна на медикаментозно въздействие.

Трансфузиите с MSC са безопасни, без съпровождаща токсичност и без данни за ектопично разрастване, независимо от източника и начина на извличането им. Предимство при изготвянето на MSC суспензии за терапия е получаването им от независими донори (3^rd part). Даден пациент дори може да бъде трансфузиран последователно с MSC от два или повече различни донори, независими от първоначалния източник на трансплантата. Съществува възможност за съхраняване на собствени (автоложни) мезенхимни клетки за бъдеща терапия, както и изготвянето на смесени (pooled) донорни MSC концентрати, които се съхраняват дълбоко замразени, в готовност за приложение по индикации (т. нар. „master cell stocks”).

 

 

Трансплантиране на генно-модифицирани клетки

Пациенти с хомозиготна форма на β-таласемия (болест на Cooley) може да бъдат излекувани дефинитивно само с трансплантация. Тези, за които не може да бъде намерен подходящ донор или е наличен повишен риск от усложнения, са подходящи кандидати за генна терапия. В хромозомите на автоложни стволови клетки, събрани с левкафереза, се интегрира терапевтичен ген за липсващата β-глобиновата верига (най-често посредством трансфер с вирусен вектор). При успех хомозиготното заболяване се трансформира в по-леката хетерозиготна форма, без нужда от хемотрансфузии. На този етап са публикувани данни за успешно осъществено лечение при единични случаи и е в ход международно клинично проучване.

 

Заключение

През последните години клетъчната имунотерапия се радва на значителен интерес не само от страна на изследователите и клиницистите, но и от фармацевтичната индустрия. По-задълбоченото разбиране на имунните механизми, иновативните идеи, възможностите за генно модифициране и технологиите за висококачествена обработка на клетъчните концентрати осигуряват платформа за много и интересни клинични проучвания. Следващият етап предполага въвеждане на успешните технологии в рутинната клинична практика. От една страна, това налага добро познаване на същността на отделните методи с цел постигане на оптимален клиничен ефект. От друга, в икономически аспект, предполага съучастие на клиничните звена, фармацевтичните фирми и здравно-осигурителната система във възстановяването на изразходваните значителни финансови средства.

 

Библиография:

1. Reis, M., Ogonek, J, Qesari, M, Borges, NM, Nicholson, L, Preußner, L, Dickinson AM, Wang XN, Weissinger EM, Richter A. Recent Developments in Cellular Immunotherapy for HSCT-Associated Complications. Front Immunol. 2016 Nov 14;7:500.
2. Rager A, Porter DL. Cellular therapy following allogeneic stem-cell transplantation. Ther Adv Hematol. 2011 Dec;2(6):409-28.
3. A Saad and LS Lamb. Ex vivo T-cell depletion in allogeneic hematopoietic stem cell transplant: past, present and future. Bone Marrow Transplantation (2017), 1–8
4. Lim O, Jung MY, Hwang YK, Shin EC. Present and Future of Allogeneic Natural Killer Cell Therapy. Front Immunol. 2015 Jun 3;6:286
5. Zhao and Liu The clinical application of mesenchymal stromal cells in hematopoietic stem cell transplantation Journal of Hematology & Oncology (2016) 9:46
6. Maria-Teresa Cutino-Moguel, Chris Eades, Katayoun Rezvani and Darius Armstrong-James. Immunotherapy for infectious diseases in haematological immunocompromise. Br Journal of Haemаtology, 2017, 177, 348–356
7. Miller JS, Soignier Y, Panoskaltsis-Mortari A, McNearney SA, Yun GH, Fautsch SK, et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentica NK cells in patients with cancer. Blood (2005) 105(8):3051–7.
8. Rubnitz JE, Inaba H, Ribeiro RC, Pounds S,RooneyB,BellT,et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J ClinOncol (2010) 28(6):955–9.
9. Iliopoulou EG, Kountourakis P, Karamouzis MV, Doufexis D, Ardavanis A, Baxevanis CN, et al. A phase I trial of adoptive transfer of allogeneic natural killer cells in patients with advanced non-small cell lung cancer. Cancer ImmunolImmunother (2010) 59(12):1781–9.
10. Koehl, U., Esser, R., Zimmermann, S., Tonn, T., Kotchetkov, R., Bartling, T. et al. (2005) Ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children. Klin Padiatr 217: 345–350.
11. Ciceri, F., Bonini, C., Stanghellini, M.T., Bondanza, A., Traversari, C., Salomoni, M. et al. (2009) Infusion of suicide-gene-engineered donor lymphocytes after family haploidentical haemopoietic stem-cell transplantation for leukaemia (the TK007 trial): a non-randomised phase I-II study. Lancet Oncol 10: 489–500.
12. Chen, B.J., Deoliveira, D., Cui, X., Le, N.T., Son, J., Whitesides, J.F. et al. (2007) Inability of memory Tcells to induce graft-versus-host disease is a result of an abortive alloresponse. Blood 109: 3115–3123.
13. van den Brink, M.R., Porter, D.L., Giralt, S., Lu, S.X., Jenq, R.R., Hanash, A. et al. (2010) Relapse after allogeneic hematopoietic cell therapy. Biol Blood Marrow Transplant 16(Suppl.): S138–S145
14. Brunstein, C.G., Miller, J.S., Cao, Q., McKenna, D.H., Hippen, K.L., Curtsinger, J. et al. (2011) Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood 117: 1061–1070
15. Porter, D. and Levine, J.E. (2006) Graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia after donor leukocyte infusion. Semin Hematol 43: 53–61.
16. di Ianni M, Falzetti F, Carotti A, et al. Tregs prevent GvHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 2011;117:3921–3928.
17. Ukena SN1, Höpting M, Velaga S, Ivanyi P, Grosse J, Baron U, Ganser A, Franzke A. Isolation strategies of regulatory T cells for clinical trials: phenotype, function, stability, and expansion capacity. Exp Hematol. 2011 Dec;39(12):1152-60.