Диагностичен алгоритъм за оценка на имунното здраве при деца

Н. Гешева, Сн. Михайлова, П. Янкова,

Сп. Лесичкова, М. Балева, A. Михайлова, Е. Наумова

Клиника по клинична имунология с банка за стволови клетки,

УМБАЛ “Александровска“, МУ – София

 

Първичните имунни дефицити (ПИД) са хетерогенна група наследствени заболявания, при които се наблюдава нарушение във функцията на имунната система. Засегнатите индивиди се представят с чести и тежко протичащи инфекции, имунна дисрегулация с развитие на автоимунитет и склонност към злокачествени заболявания. При повечето дефицити клиничната изява започва в ранна детска възраст. До момента са идентифицирани около 300 гена, имащи отношение към развитието на ПИД.

Класификация на имунните дефицити

Съществуват множество различни класификации на тези заболявания, обикновено на базата на засегнатия компонент на имунната система. Понастоящем приетата от International Union of Immunological Societies Expert Committee for Primary Immunodeficiency класификация разделя имунните дефицити в девет групи:

• Имунодефицити (ИД), засягащи клетъчния и хуморалния имунитет;
• Комбинирани ИД с добре обособени синдроми;
• Предимно антителни дефицити;
• Заболявания на имунната дисрегулация;
• Вродени дефекти в броя на фагоцитите, тяхната функция или и двете;
• Дефекти във вродения имунитет;
• Автоинфламаторни заболявания;
• Дефицити в компоненти от системата на комплемента;
• Фенокопия на ПИД.

 

Диагностициране

В зависимост от клиничната изява, параклиничните и генетични изследвания, диагнозата може да бъде поставена с различна степен на сигурност, в зависимост от което тя се определя като възможна, вероятна или дефинитивна:

 

• Диагнозата е възможна при наличие на някои, но не на всички клинични и лабораторни характеристики на даден ПИД;
• Диагнозата е вероятна, когато са налични всички клинични и лабораторни характеристики на даден ПИД, но няма документирана абнормалност на гена или протеина;
• Диагнозата е дефинитивна, когато се установи наличие на мутация в гена или абнормален протеин, за които се знае, че са свързани с проявата на даден ПИД.

 

При пациентите с дефинитивна диагноза вероятността, че след 20 години ще им бъде поставена същата диагноза, е >98%. Тъй като не при всички ПИД е идентифициран подлежащият генетичен дефект, при част от тях обаче не е възможно поставяне на дефинитивна диагноза.

Първичните имунни дефицити имат много клинични сходства с вторичните, които могат да възникнат по време на определени вирусни инфекции, при използване на имуносупресивни медикаменти за предотвратяване на отхвърляне на присадката след трансплантация, по време на лечение на системно автоимунно заболяване или във връзка с химиотерапия при онкологично заболяване. Това налага изключване на вторичен имунен дефицит като причина за съответната симптоматика. Оценка на имунната система е необходимо да бъде осъществена при:

 

• Рекурентни или тежки инфекции;
• Инфекции, трудно отговарящи на подходяща антибиотична терапия;
• Пациенти с опортюнистични инфекции;
• Изоставане във физическото развитие;
• Хронична диария или малабсорбция;
• Възрастни с ХОББ в асоциация с бронхиектазии;
• Рекурентни кожни инфекции;
• Нарушено заздравяване на рани;
• Студени стафилококови абсцеси;
• Персистиращ или рекурентен периодонтит;
• Пациенти с рекурентни инфекции, причинени от Neisseria;
• Пациенти с клинични и лабораторни данни за синдроми, асоциирани с имунодефицит (тромбоцитопения, малки тромбоцити, албинизъм, атаксия, телеангиектазия, дисморфни белези, сърдечни аномалии, хипокалциемия и други);
• Фамилна анамнеза за ПИД в семейството; необяснима смърт на новородено или малко дете; смърт, причинена от инфекция; автоимунни или онкохематологични заболявания; кръвно-родствени бракове.

 

За определяне на диагностичните имунологични тестове, които да бъдат приложени, от изключителна важност са анамнестичните данни с информация за началната възраст на клинична изява, локализацията на инфекциите, както и информация за вида на изолираните микроорганизми и отговора към приложената терапия. Обикновено тежките комбинирани имунодефицити, както и фагоцитните дефекти са с начална изява в ранния неонатален период. Антителните дефицити се проявяват към 6-8-месечна възраст, след изчерпване на трансплацентарно преминалия IgG от майката. Правило е, че колкото по-ранна е клиничната изява на даден ИД, толкова по-тежък е той. Изолирането на определен микроорганизъм като причинител на инфекция при пациенти със съмнение за ПИД може да насочи към засягането на определен компонент на имунната система (табл. 1).

 

Таблица 1. Инфекциозни причинители, насочващи към съответен ПИД.

Инфекциозен причинител	Тип дефицит
Рекурентни инфекции със Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae	Ig, C2, or IRAK-4 дефицит
Рекурентни инфекции с Giardia intestinalis (lamblia)	Антителни дефицити
Инфекции с Pneumocystis, cryptosporidium или toxoplasmа	Т-клетъчни дефекти
Вирусни, гъбични или микобактериални (опортюнистични) ифекции	Т-клетъчни дефекти
Клинични инфекции след приложение на живи атенюирани ваксини (напр. варицела, полио, BCG)	Т-клетъчни дефекти
Стафилококови инфекции, инфекции с грам-негативни микроорганизми (напр. Serratia или Klebsiella sp), или гъбични инфекции (напр. аспергилус)	Фагоцитни дефекти или хипер IgЕ синдром
Кожни инфекции	Неутрофилни дефекти или имуноглобулинов дефицит
Рекурентни гингивити	Неутрофилни дефекти
Рекурентни инфекции с Neisseria	Определени дефекти в системата на комплемента

 

Физикалният преглед също е от голямо значение за насочване към вида на имунния дефицит. При ИД с добре обособени синдроми е възможно да има малформативни стигми, както например при част от децата със синдром на DiGeorge. Обикновено при тежките комбинирани имунни дефицити се наблюдава изоставане в растежа и развитието на децата. Често пъти при тях има и различни кожни прояви като например еритродермия, която е изява на реакция на присадката срещу гостоприемника (GVHD) вследствие на преминали трансплацентарно майчини имунокомпетентни Т-лимфоцити в дете с дефицит в развитието на неговите собствени Т-клетки. Кожни прояви като студени стафилококови абсцеси и кожни грануломи могат да се наблюдават при дефицити във фагоцитната функция. При атаксия телeангиектазия може да се наблюдават телeангиектазии по кожата и склерите. В други случаи като при Wiskott Aldrich синдрома например се наблюдават кожни кръвоизливи поради съпътстваща патология в множество системи, в това число и кръвотворенето – наличието на малки тромбоцити с нарушена функция. Друг важен момент при физикалния преглед е оценка на лимфните възли (ЛВ). При някои пациенти с ИД е възможно наличие на лимфаденомегалия – като например при ALPS (автоимунен лимфопролиферативен синдром) или при XLA (X-свързана агамаглобулинемия): поради дефект в развитието на В-лимфоцитите на етап про-В-клетки в костния мозък, в периферната кръв липсват В лимфоцити, което води до липса на герминативни центрове във вторичните лимфоидни органи и като резултат при тези деца не се наблюдават тонзили. Трябва да се има предвид обаче, че при болни с ПИД е възможно физикалният преглед да бъде нормален. Поради многообразието от ИД, първоначалната оценка на имунната система се поставя въз основа на насоките, които лекарят има от анамнестичните данни, прегледа, информацията от ПКК с ДКК и изолираните микроорганизми. Следва се следния алгоритъм с препратка към алгоритмите за специфичните основни групи ИД:

• При съмнение за ПИД и наличие само на синопулмонални инфекции се извършват имунологични тестове в насока хуморален имунен дефицит;
• При наличие на инфекции с Neisseria, абсцеси и/или гъбични инфекции, атипични микобактерии, опортюнистични причинители и дисеминирани инфекции се извършват имунологични тестове за дефицити в системата на комплемента, фагоцитни дефекти или дефекти във вродения имунитет;
• При съмнение за клетъчен или комбиниран имунен дефицит се провеждат изследвания на Т-, В- и NК-клетки, пролиферативен отговор след стимулация с антигени и митогени, имуноглобулини и постваксинален отговор и др.

Имунологични изследвания

Най-общо имунологичните изследвания могат да се разделят на две основни категории – скриниращи имунологични изследвания и специализирани имунологични изследвания.

 

Скриниращи изследвания за оценка на хуморалните имунни дефицити

Скриниращите изследвания за оценка на хуморалните имунни дефицити са:

• Изследване на серумните имуноглобулини – IgG, IgM, IgA, IgE и IgG-субкласове. Поради специфичната кинетика в антителната продукция при децата е необходимо получените резултати винаги да се сравняват с референтните за съответната възрастова група.
• Измерване на изохемаглутининов титър. Анти-А и анти-В нормално не присъстват при новородени поради неспособност за синтеза. Ако присъстват, то те са от IgG–клас и са с майчин произход. Антителата се развиват между 3- и 6-месечна възраст вследствие на неизвестен антигенен стимул, вероятно бактерии или храни. Най-висок титър достигат между 5-10-годишна възраст, след което поддържат сравнително постоянно ниво, а с остаряването постепенно намаляват. Изследването на изохемаглутининов титър не е надеждно при деца под 6-месечна възраст, както и при хора с АВ кръвна група.
• Изследване на специфичен антителен титър. Използва се за оценка на антителния отговор към протеинови (най-често анти-дифтериен и анти-тетаничен) и полизахаридни антигени (относително Т-клетъчно независим отговор, например анти-пневмококов или към Typhum Vi). Трябва да се вземе в съображение, че поради незрелостта на имунната система в ранна детска възраст, деца под 2-годишна възраст не отговарят с образуване на антитела при използване на неконюгирана полизахаридна ваксина. За оценка на специфичен антителен отговор към конкретни антигени е необходимо преди това детето да е било в контакт с тях, т.е. лекарят да има информация за имунизационната схема на конкретния изследван пациент.

 

Специализирани изследвания за оценка на антителните дефицити

Към специализираните тестове за оценка на антителните дефицити спадат:

• Оценка на антителния отговор след бустер имунизация. Обикновено за адекватен постваксинален отговор се приема четирикратно повишаване на титъра спрямо този преди реваксинацията. За протективно ниво на анти-пневмококови антитела за даден серотип се счита 1.3 микрограма/мл. В случай, че нивото е над 1.3 микрограма/мл преди реваксинацията, за адекватен постваксинален отговор се счита двукратно повишаване на титъра. При деца под 5-годишна възраст, в случай че при 50% oт използваните за реваксинация серотипове се наблюдава съответното увеличение, се приема, че детето има адекватен отговор.
• Флоуцитометрично определяне на В-лимфоцити и техните субпопулации (табл. 2).
• Инвитро оценка на имуноглобулиновата продукция след стимулация с митогени.
• Инвитро оценка на имуноглобулиновата продукция в отговор на стимулация с анти CD40 и цитокини. При добавяне на IL4 се оценява синтезата на IgЕ, а при добавяне на IL10 синтезата на IgМ и IgG.
• Използване на протеинови неоантигени KLH (keyhole limpet hemocyanin) и бактериофаг ØX174. Това позволява оценка на първичен и вторичен имунен отговор, памет, превключване на класа.
• Провеждане на биопсия на ЛВ, ректална мукоза, костен мозък.

 

Табл. 2. Флоуцитометрично определяне на В-лимфоцити и техните субпопулации.

В-клетъчни субпопулации	Фенотип
Наивни В-лимфоцити	IgM+IgD+CD27-
Превключили класа паметови В-лимфоцити	IgM-IgD-CD27+
Активирани В-лимфоцити	CD21lowCD38low
Транзиторни В-лимфоцити	CD38hiIgMhi
Maргинално зонови В-лимфоцити	IgMhiIgDlowCD1c+CD21hiCD23−CD27+
Плазмабласти	CD38+++IgM-

 

Скриниращи изследвания за оценка на клетъчния имунен отговор

• Кожно алергични проби на забавена свръхчувствителност (КАП). При използването им е необходимо да се вземе под внимание незрелостта на имунната система в ранна детска възраст, както и възможността отсъствието на позитивна реакция да се дължи на липсата на предварителна среща на изследваното дете с даден антиген. Поради това тези проби не се препоръчват като тест за оценка на клетъчния имунитет при деца под 1-годишна възраст. При липса на позитивни КАП оценката на клетъчно медиирания имунен отговор е необходимо да се проведе чрез in vitro лимфопролиферативен отговор към специфичните антигени. Редица състояния – недохранване, тежък атопичен дерматит, инфекции, причинени от M tuberculosis, морбили, паротит, HIV, грип, инфекциозна мононуклеоза, гъбички и паразити, пациенти със саркоидоза, пациенти на имуносупресивна терапия и пациенти с малигнени заболявания, могат да доведат до анергия с отрицателни КАП на база на вторичен клетъчен имунен дефицит.
• Флоуцитометрично определяне на лимфоцитните субпопулации (T, B, NK). Изследването дава информация за разпределението на клетките на имунната система в периферната кръв. Обикновено при повечето от клетъчните имунни дефицити се наблюдава значително понижение на общите Т=лимфоцити с диспропорционално разпределение на хелперно-индусерната (CD3+CD4+T) и супресорно-цитотоксичната (CD3+CD8+T) им субпопулация, както и диспропорции в разпределението между наивни и паметови Т-лимфоцити.

 

Специализирани тестове за оценка на клетъчния имунен отговор

Към специализираните тестове за оценка на клетъчния имунен отговор се отнасят:

• Изследване на някои ензими (аденозин дезаминаза, пурин нуклеотид пептидаза).
• Инвитро пролиферативни отговори към митогени и антигени.
• Инвитро оценка на експресия на повърхностни маркери и цитокинова продукция след стимулация.
• Цитоплазмено протеиново фосфолириране в отговор на стимули.
• Определяне на NK клетъчна цитотоксичност.
• Изследване на Т-клетъчни ексцизионни кръгове (TRECs). Въвеждането на рутинно скринингово изследване за TRECs в ранния неонатален период би било от изключително важно значение за ранната диагностика на Т-клетъчните дефицити, вкл. тежките комбинирани имунни дефицити, с възможност за профилактична терапия и бързо намиране на подходящ донор за трансплантация на хемопоетични стволови клетки, още преди развитието на сериозни инфекциозни компликации. Ранното диагностициране на тези ПИД би предотвратило още и прилагането на ваксини, които при тези деца водят до развитие на постваксинални животозастрашаващи инфекции.

 

Скриниращи методи за оценка на фагоцитната функция

• Изследване на ПКК с диференциално броене.
• Морфология на неутрофилите.

 

Специализирани тестове за оценка на фагоцитната функция

• Оценка на оксидативната функция. Чрез използване на различни видове тестове (dihydrorhodamine, nitroblue tetrazolium, chemiluminescence).
• Флоуцитометрична оценка на повърхностната експресия на адхезионни молекули от лимфоцити и неутрофили.
• Оценка на хемотаксиса.
• Оценка на фагоцитозата.
• Изследване на различни ензими, включени в процеса на вътреклетъчно убиване (миелопероксидаза, глюкозо 6 фосфат дехидрогеназа).
• Левкоцитен търновър кръговрат.
• Костномозъчна биопсия.

 

Скриниращи методи за оценка на системата на комплемента

• Тестове СН50 и АН50.

 

Специализирани методи за оценка на системата на комплемента

• Ниво или функция на отделни компоненти на системата на комплемента.
• Хемотаксисна активност на различните анафилатоксини, образувани при активирането на системата на комплемента.

За поставяне на дефинитивна диагноза се използват молекулярно-биологични методи, включващи Southern, Northern, и Western блот, PCR/SSCP, DNA fingerprinting, ДНК-секвениране и други. Установяването на точната мутация при дадено заболяване е от изключителна важност в семействата с оглед провеждане на генетична консултация за планиране, наблюдение и при необходимост – пренатална диагностика при една последваща бременност.

 

В заключение

Голямото разнообразие на ПИД и често пъти припокриващата се клинична изява между различните заболявания изключително много затрудняват поставянето на диагнозата. Това налага познаването и използването на диагностичните подходи и имунологичните тестове, което би позволило навременно диагностициране и започване на адекватна, а в част от случаите и животоспасяваща терапия. В това отношение ключова роля имат Експертните центрове по редки болести-ПИД. Но за да достигнат до тях, пациентите трябва да бъдат насочени от лекуващите им лекари (ОПЛ, педиатри и други специалисти), които трябва да познават добре клиничните и параклиничните симптоми, свързани с ПИД.

 

Библиография:

1. Picard, C., Gaspar, B.,Al-Herz, W., Bousfiha, A., Casanova, J.L., Chatila, T., Crow, Y.J.,  Cunningham-Rundles, C., Etzioni, A., Franco, J.L., Holland, S.M.,  Klein, C., Morio, T., Ochs, H.D., Oksenhendler, E.  International Union of Immunological societies: 2017. Primary immunodeficiency diseases Committee Report on Inborn Errors of Immunity. Journal of Clinical Immunology. January, 2018. Vol. 38. 1:96-128.
2. Bonilla, F., Bernstein, I.L., Khan, D.A., Ballas, Z.K., Chinen, J., Frank, M., Kobrynski, L.J., Levinson, A.I., Mazer, B., Nelson, R., Orange, J.S., Routes, J.M., Shearer, W.T. and Sorensen. R.U. Practice parameter for the diagnosis and management of primary immunodeficiency. Annals of allergy, asthma and immunology. Vol. 94. 2005.
3. Madkaikar, M., Mishra, A. and Ghosh, K. Diagnostic Approach to Primary Immunodeficiency Disorders. Indian Pediatrics. Vol. 50. 2013.
4. Orange, J., Ballow, M., Stiehm, E.R., Ballas, Z., Chinen, J., De La Morena, M., Kumararatne, D., Harville, T.O., Hesterberg, P., Koleilat, M., McGhee, S.,  Perez, E., Raasch, J., Scherzer, R., Schroeder, H., Seroogy, C., Huissoon, A., Sorensen R., Katial, R. Use and interpretation of diagnostic vaccination in primary immunodeficiency: A working group report of the Basic and Clinical Immunology Interest Section of the American Academy of Allergy, Asthma and Immunology. J Allergy Clin Immunol. 2012. 130:S1-24.