Вродени грешки на обмяната. Метаболитна криза – метаболомен подход за диагностика в България

М. Иванова^{1, 2}, Ив. Синигерска¹, Д. Димитров¹, В. Йорданова¹, И. Кременски¹

¹Национална генетична лаборатория, СБАЛАГ „Майчин дом”, София

²Факултет по химия и фармация, СУ „Св. Кл. Охридски”, София

 

Вродените грешки на обмяната (ВГО) са свързани със засягането на множество органи и системи поради метаболитния дисбаланс, което води до неспецифична клинична презентация. Това силно затруднява, а в някои случаи прави невъзможно поставянето на диагноза на клинично ниво с помощта на рутинните лабораторни изследвания. Необходими са допълнителни специализирани изследвания, базирани на високотехнологични аналитични методи за поставяне на диагноза, свързана с ВГО. Метаболомният подход (определяне на метаболитния профил в различни биологични течности и тъкани) в програмите за селективен скрининг за ВГО е най-ефективният и надежден подход за диагностика на тези редки заболявания. Навременната и точна диагноза е от решаващо значение за терапевтичното поведение за предотвратяване на остра метаболитна декомпенсация, която може да доведе до необратими неврологични увреждания и смърт.

В настоящата статия е представен метаболомният подход в България за диагностика на ВГО, голяма част от които се презентират с остра метаболитна криза, провокирана от инфекция, стресова ситуация или гладуване.

Лабораторен подход за диагностика на ВГО

Наследствено метаболитно заболяване може да бъде диагностицирано на три нива: чрез откриване на генния дефект; чрез доказване на абнормния генен продукт (намалена или липсваща ензимна активност); чрез доказване на абнормни концентрации на метаболит/и вследствие на нарушение в метаболитния поток, т.е. изследване на метаболома. Последният подход, наречен метаболомен подход, е най-ефективният подход за откриване на болни индивиди. Характеризира се с едновременно количествено определяне на огромен брой ниско-молекулни метаболити – органични киселини, аминокиселини, ацилкарнитини, карнитин, генериране на метаболитен профил, на базата на което се предполага определена ВГО, след което на ензимно или ДНК ниво се поставя окончателната диагноза. Метаболомният подход е мощното средство в световната лабораторна практика за диагностика на ВГО, защото измерването на метаболитите в клетки, тъкани и биологични течности може да бъде и най-директната мярка за ендофенотипа, тъй като метаболитният отговор в живия организъм се променя под въздействие на болестни състояния или фактори на околната среда (лекарства, диети, хранителни формули). Аналитичната платформа на този подход е базирана на високоспециализирани технологии като газова хроматография с масспектрометрия (GC/MS), течна хроматография с тандем масспектрометрия (LC-MS/MS), ядрено-магнитно-резонансна спектроскопия (NMR) и други.

Принципно диагностиката на ВГО се извършва под формата на масов (неонатален, предсимптомен) и селективен генетичен скрининг.

 

Масов скрининг

Масовият неонатален скрининг обхваща всички новородени деца с цел предсимптомно откриване на болните за провеждане на ефективно патогенетично лечение за предотвратяване на необратими увреждания на органи и системи и за ограничаване на остра метаболитна декомпенсация при някои ВГО. Предмет на този скрининг са ВГО, които отговарят на общоприетите световни критерии. В Европа броят на ВГО, включени в масов скрининг, варира от 2 (ФКУ, MCAD) до 20 заболявания. В България се провежда само за фенилкетонурия (ФКУ) от ВГО.

Биологичният материал за изследване: пълна кръв, която се взима върху специална филтърна хартия S&S 903 (филтърна бланка) под формата на 5 сухи петна на 2-5-тия ден след раждането във всички родилни домове в България. От тази кръвна проба в България освен за ФКУ се извършва масов скрининг за вроден хипотиреодизъм и надбъбречна хиперплазия.

 

Селективен скрининг

Селективният скрининг е сложен и многоетапен процес, който включва използването на високотехнологични и скъпоструващи аналитични методи, базирани на газова хроматография с масселективна детекция (GC/MS), тандем масспектрометрия (MS/MS) и ензимни и ДНК анализи.

Основна задача на селективния скрининг е поставянето на окончателна диагноза след предварителна селекция по клинични, лабораторни, етнически, географски и други критерии или след положителен резултат от масовия скрининг с цел:

• провеждане на ефективно лечение и рехабилитация при някои ВГО за предотвратяване на остра метаболитна декомпенсация, която може да доведе до необратими увреждания и смърт;
• предлагане на адекватно генетично консултиране;
• предлагане на пренатална диагностика при последващи бременности.

В България диагностика на ВГО се извършва в рамките на селективна скринингова програма, която се изпълнява в Националната генетична лаборатория, София.

 

Биологичен материал за диагностика ВГО

От критично важно значение за точната и навременна диагноза при ВГО е времето на пробовземане, транспортирането на пробата до специализираната лаборатория (за България – Национална генетична лабoратория, София) и информацията, описана в специализирания документ „Поръчка: вродени грешки на обмяната”, придружаващ биологичните проби за анализ (съдържат се данни за клиничната манифестация, рутинните лабораторни изследвания, клиничното състояние на пациента – криза или асимптомен, в момента на пробовземане, хранителния режим и терапията в последните 48 часа.

Голяма част от пациентите с ВГО загиват от усложненията, възникнали преди поставянето на диагнозата, и поради това най-често попадат в регистрите с причина за смъртта „пневмония и грип” или „други причини”. Често ВГО погрешно се диагностицират като сепсис или синдром на внезапната детска смърт, с неясна етиология. Установено е, че 3-6% от случаите с внезапна смърт в детска възраст са в резултат на дефекти в бета-окислението на мастните киселини.

В тази връзка при поява на симптоми от интоксикационен тип (повръщане, летаргия, кома и чернодробна недостатъчност) или симптоми в резултат на енергиен дефицит (хипотония, кардиомиопатия, сърдечна недостатъчност, циркулаторен колапс, синдром на внезапната смърт) или при документирани хиперамониемия, хипогликемия, ацидоза/алкалоза, хиперлактатемия е необходимо преди започване на лечението да се вземат посочените в Таблица 1 биологични материали за провеждане на селективен метаболитен скрининг. Взетите проби трябва да се изпратят в НГЛ до 24 часа след пробовземането и да бъдат придружени от „Поръчка: вродени грешки на обмяната“. Пробата може да се съхранява до 24 часа при температура 4-8°С. Неправилното съхранение може да доведе до грешни резултати или до пропускане на диагнозата. Например в урина,  съхранявана при  стайна температура, може да се наблюдава загуба на кетокиселини – важна диагностична група метаболити. Анализът на урината е едно от възловите изследвания за диагностика на органичните ацидурии, ДУЦ, аминоацидурии и дефекти в окислението на мастните киселини. Успоредно с провеждането на патогенетичното лечение и изключването на възможните други причини за състоянието на пациента, трябва да продължи събирането на колкото е възможно по-голямо количество урина. Не бива да се забравя, че дори в случаите на летален изход от пациента трябва да се събере и запази материал за изследване (кръв, урина, ликвор), тъй като специализираното лабораторно изследване под формата на селективен скрининг е единствената възможност да се постави или отхвърли диагнозата. Само точно поставената диагноза дава възможност за предоставяне на адекватно медико-генетично консултиране и евентуално провеждане на пренатална диагностика при следваща бременност.

Трябва да се има предвид, че биологичните проби, взети на гладно или в момент на метаболитна криза, имат много по-висока информативна стойност, тъй като при някои ВГО диагностично-значимите метаболити са в рамките на референтните стойности, когато пациентът е в „светъл” период. Например при глутарова ацидемия тип 1 глутаровата киселина и 3-хидроксиглутаровата киселина в урината може да са в норма, когато пациентът не е в криза. При средно-верижния ацил-СоА дехидрогеназен дефицит (MCAD) диагностично-значимите ацилглицини в урината са в нормални граници извън метаболитна криза. Множественият ацил-КоА дехидрогеназен дефицит (глутарова ацидурия тип 2) обикновено биохимично се презентира с повишени етилмалонат, глутарат и адипат, но тези метаболити са в повишени концентрации и при други ВГО. Когато пациентьт е в криза, се наблюдават още конюгати на глицина – изовалерилглицин, изобутирилглицин, 2-метилбутирилглицин и 2-хидроксиглутарат, което насочва към правилната диагноза.

 

Табл. 1. Биологичен материал за специализирани изследвания при съмнение за ВГО.

Биологичен материал	Количество	Транспорт до НГЛ	Съхранение, специални изисквания
Кръв върху ФБ	Поне 2 петна, добре попили  върху филтърната хартия S&S 903	Околна температура	Стайна температура, без пряка слънчева светлина, далеч от топлинни източници
Кръв с К EDTA	3-5 мл	Околна температура	Не се замразява до отделяне на левкоцити и плазма
Урина	10 мл, мин. 5 мл	В лед	-20°С – 1 месец; -70°С – 5 години
Ликвор *	1 мл	В лед	-70°С – 1 година

*при Некетотична хиперглицинемия; ФБ – филтърна бланка (предоставя се от НГЛ)

 

Системен ход за диагностика на ВГО

Ефективността на селективния скрининг е пряко зависима от прилагането на подходящ системен ход от високонадеждни специализирани лабораторни методи за диагностика. На Фиг. 1 е показан схематично моделът на селективен скрининг за диагностика на ВГО, който е разработен и въведен в рутинната практика на Национална генетична лаборатория (НГЛ). Той започва с анализ на клиничната и рутинна лабораторна информация за пациента и семейството, предоставена от клинициста в документа „Поръчка: вродени грешки на обмяната“, който задължително придружава биологичните материали за изследване. На базата на клиничната картина, рутинните клинико-лабораторни изследвания, данните за фамилна история и етнос (някои ВГО са с висока честота при определени етноси) и други критерии се избира подходящ аналитичен ход за бърза и ефективна диагностика. Трябва да се отбележи, че на всички проби урина, постъпили в НГЛ за изследване със съмнение за ВГО, задължително се извършва т. нар. „Общ метаболитен скрининг“, който включва химичен полуколичествен анализ с тест-лента, определяне на глюкоза, редуциращи субстанции, фенилкетони, метилмалонова киселина и кетокиселини. Този предварителен анализ служи за оценка на качествата на материала и на интерфериращите фактори, като при позитивиране насочва към определена група ВГО. Например, позитивен тест за нитрити предполага наличието на бактерии, което означава, че в урината няма да се определят надеждно мукополизахаридите, олигозахаридите, аминокиселините, а при интерпретацията на органичните киселини може да се генерира профил, който погрешно да се асоциира с ВГО. Позитивен тест за редуциращи субстанции и отрицателен тест за глюкоза в урината, независимо от поръчаното от клинициста изследване, предполагат спешно изследване на галактозата в кръвта и евентуално ензимен анализ за изключване на класическа галактоземия.

Селективният скрининг винаги стартира със скриниращи анализи, с помощта на които в зависимост от резултатите лабораторно-диагностичният процес ще продължи по определен аналитичен алгоритъм, използващ различни методи за потвърждаване и поставяне на окончателната диагноза. За всяка група ВГО (аминоацидопатии, органични ацидурии, ДУЦ, дефекти в бета-окислението на мастните киселини, пероксизомни болести, лизозомни болести) са разработени и се прилагат различни аналитични алгоритми за изследване. Например, при съмнение за органична ацидурия скриниращите анализи включват: общ метаболитен скрининг на урина и ацилкарнитинов и аминокиселинен профил в кръв върху филтърна бланка, а потвърждаващите анализи – профил на органични киселини в урина, карнитин, ацилкарнитини и аминокиселини в плазма (изолирана от пълната кръв с КEDTA, веднага след доставянето й в НГЛ), а окончателната диагноза се поставя чрез ензимен анализ в левкоцити, фибробласти или ДНК анализ (най-често).

В зависимост от клиничната картина скринингът може да стартира с изследване на дълговерижни мастни киселини за диагностика на пероксизомни болести или специфичен ензимен анализ за лизозомни болести.

Важно е да се отбележи, че при метаболомния подход за диагностика след извършване на каскада от последователни високоспециализирани анализи, получените резултати се оценяват комплексно в констелацията на клиничната картина, фамилната история, предварителните лабораторни данни (ПКК, КАС, амоняк, лактат, плазмена глюкоза, кетони и други), хранителния режим и терапията на пациента. С изключителна важност за правилното интерпретиране на резултатите е информацията за режима и терапията на пациента през последните 48 часа, тъй като приемът на редица медикаменти и хранителни формули и добавки може да доведе до сигнификантно отклонени диагностично-значими метаболити. Например, при използване на медицински хранителни формули с повишено съдържание на средноверижни триглицириди метаболитният профил е подобен на този при дефекти във бета-окислението на мастните киселини, с повишена екскреция на средноверижни (С8-С12) наситени дикарбоксилови киселини с четен брой въглеродни атоми, но без екскреция на ацилглицини. Също така редица лекарства водят до повишена екскреция на органични киселини, което може да затрудни оценяването на метаболитния профил и да доведе до грешки. Така например, лечението с валпроева киселина (Депакин) води до повишено излъчване на 3-хидроксиизовалерат, 5-хидроксихексаноат, 7-хидроксиостаноат, р-хидроксифенилпируват, дикарбоксилови киселини и в по-малка степен на хексаноилглицин, тиглилглицин и изовалерилглицин, което е харктерно при MCAD.

Комплексното оценяване на метаболитния профил (специфични метаболити и съотношения в концентрациите) е от решаващо значение за поставянето на правилна диагноза на метаболитно ниво. Много често единични метаболити във високи концентрации нямат диагностична стойност, а в други случаи дискретни отклонения може да насочат към точната диагноза (сукцинилацетон при тирозинемия тип 1, мевалонова киселина при мевалонова ацидурия, N-ацетиласпартат при болест на Канаван, 4-хидроксициклохексилацетат при халкинсинурия и др.)

След комплексно оценяване на резултатите от всички анализи се поставя диагноза на метаболитно ниво, но дефинитивната диагноза се поставя на ензимно и/или ДНК ниво. При сигурна биохимична диагноза намирането на молекулната причина за заболяването не е проблем, тъй като за почти всички ВГО гените са известни. При некатегорични метаболитни находки, насочващи към повече от едно метаболитно заболяване, обаче,  решаваща роля при поставянето на дефинитивната диагноза за ВГО играе секвенирането от ново поколение на повече гени.

Всички лични данни и резултати се съхраняват в електронен регистър, а биологични материали на болните индивиди се съхраняват в биобанка.

В Таблица 2 са показани групите заболявания от ВГО, при които е възможна постнатална диагноза в България.

Внимание: Пълна информация за ВГО и за необходимите документи за изследване могат да се намерят на електронната страница на Националната генетична лаборатория – www.genetika.maichindom.com

 

Фиг. 1. Системен аналитичен алгоритъм за диагностика на вродени грешки на обмяната в НГЛ.

VLCFA – very lоng chain fatty acids; GC/MS – газ хроматография/масспектрометрия; MS/MS – тандем масспектрометрия; МПЗ – мукополизахариди; DMB-метод; TLC – тънкослойна хроматография

 

 

Табл. 2. Групи ВГО, при които е възможна постнатална диагностика в България.

ВГО	МЕТОД **	БИОЛОГИЧЕН МАТЕРИАЛ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ
Органични ацидурии	GC/MS, MS/MS	урина, кръв – ФБ, кръв – ЕДТА
Аминоацидопатии	MS/MS, GC/MS	кръв – ФБ, урина, кръв – ЕДТА
ДУЦ	MS/MS, GC/MS	кръв – ФБ, урина, кръв – ЕДТА
Дефекти в b-оксислението на мастните киселини	MS/MS, GC/MS	кръв – ФБ, урина, кръв – ЕДТА
Пероксизомни болести	GC/MS	кръв – ЕДТА
Галактоземия	* Ензимен	урина, кръв – ФБ
Лизозомни болести	* Ензимен	урина, кръв – ЕДТА, кожни фибробласти

ФБ – филтърна бланка (предоставя се от НГЛ);

* Възможна е пренатална диагностика.

** Посочен е основният диагностичен метод, дефинитивната диагноза се поставя на ензимно или ДНК ниво.

 

Заключение

Диагностиката на ВГО в България се извършва чрез метаболомен подход в рамките на селективна скринингова програма в НГЛ.

Диагностиката на ВГО е предизвикателство за клинициста и лабораторния специалист. Основно изискване при интерпретацията на метаболитния профил е сътрудничеството на клиничния химик и клинициста. От една страна, информацията за клиничната картина, диетата и лечението е необходима на клиничния химик за прецизиране на интерпретацията на метаболитния профил и за извършване на допълнителни тестове при изясняване на произхода на патологичните находки. От друга страна, клиничният химик може да информира клинициста за възможния произход на абнормния профил (наследствена ВГО, функционален хранителен дефицит, ендогенна или екзогенна токсикация) и възможностите за по-нататъшни изследвания с цел поставяне на окончателната диагноза. Крайната диагноза обаче може да бъде поставена само в контекста на историята на заболяването на пациента и клиничната картина в съчетание с резултатите от биохимичните и другите високоспециализирани изследвания – ензимни и ДНК анализи.

С оглед на това да се избегнат погрешни интерпретации и фалшиво-положителни резултати, метаболитните профили винаги трябва да се интерпретират в контекста на цялостната клинична картина, хранителния режим и терапията. В този смисъл регистрирането на патологичен метаболитен профил при асимптоматични пациенти или „нормален” при суспектни за ВГО винаги трябва да бъде индикатор за повтаряне на изследването в нова биологична проба: в първия случай със задължителна по-обширна информация за терапията, диетата и патологията, свързана с ненаследствени заболявания и състояния, а във втория – по възможност в период на метаболитна криза.

 

Библиография

1. Applegarth, D.A., Toone, J.R., Lowry, R.B. Incidence of inborn errors of metabolism in British Columbia. 1969-1996. Pediatrics, 2000. 105:e10.
2. Bodamer, O.A, Hoffmann, G.F., Lindner, M. Expaneded newborn screening in Europe 2007. J Inherit Metab Dis, 2007. 30:439-444.
3. Burlina, A.B., Bonafe, L., Zacchello, F. Clinical and biochemical approach to the neonate with a suspected error of amino acid and organic acid metabolism. Semin Perinatol. 1999. 23(2):162-73.
4. Champion, M.P. An approach to the diagnosis of inherited metabolic disease. Arch Dis Child Educ Pract Ed. 2010. 95:40.
5. Weiner, D.L. Sep 20, 2017. emedicine.medscape.com
6. Leach, E.L., Shevell, M., Bowden, K., Stockler-Ipsiroglu, S., Van Karnebeek, C.D. Treatable inborn errors of metabolism presenting as cerebral palsy mimics: systematic literature review. Orphanet J Rare Dis. 2014. 9:197.
7. Mak, C.M., Lee, H.C., Chan, A.Y., Lam, C.W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Crit Rev Clin Lab Sci. 2013. 50 (6):142-62.
8. Olpin, S.E., Evans, M.J. Investigation of inherited metabolic disease after deate. Chapter in: Essentials of autopsy practice: Recent advances, Topics and Developments, Springer-Verlag London. G.N. Rutty (Ed). 2004. 17-44.
9. Sanderson, S., Green, A., Preece, M.A., Burton, H. The incidence of inherited metabolic disorders in the West Midlands, UK. Arch Dis Child. 2006. 91:896.
10. Sutton, V.R , Inborn Errors of metabolism, An Issue of pediatric Clinics of North America (the clinics&Internal Medicine). Elsevier, 1 edition, March 2018.
11. Wilson, J.M.G., Jungner, G. Principles and practice of screening for disease. Public health papers N:34. Geneva. World Health Organization. 1968.