Алгоритъм при подбор на пациенти с хипосоматотропизъм за молекулярно-генетичен анализ

А. Аройо^1,2, И. Стоева^1,2, С. Андонова^2,3, Д. Пенчева^2,7, Г. Станчева^2,7, Ш. Пашова¹, Р. Емилова¹, Ел. Стефанова^2,4, Кр. Казакова^2,4, Ив. Узунова^6,2, Р. Колева⁵, Ал. Савов³, Р. Кънева^2,7, Г. Кирилов^6,2, J. M. Wit⁸

¹ Скрининг и функционална ендокринна диагностика, СБАЛДБ „Проф. Иван Митев“

² Медицински университет – София

³ Национална генетична лаборатория

⁴ Клиника по ендокринология и генетика, СБАЛДБ „Проф. Иван Митев“

⁵ Първи диагностичен център Стара Загора

⁶ УСБАЛЕ „Акад. Иван Пенчев“

⁷ Център по молекулна медицина, Катедра Биохимия, МУ – София

⁸ Leiden University Medical Center, Leiden, Netherlands

 

Хипофизата е централен регулатор в организма на жизнени процеси като метаболизъм, отговор на стрес, растеж, пубертет, репродукция и лактация. От изключително значение за поддържането на хомеостазата в организма е нормалната органогенеза на хипофизата. Последната се контролира от сложна каскада от сигнални молекули и транскрипционни фактори (ТФ), които се експресират в строго определен времеви и пространствен порядък (фиг. 1) [1, 2, 3].

 

 

Фиг. 1. Каскада от ТФ, участващи в хипофизарната ембриогенеза [4].

 

Всяко нарушение в развитието на хипофизата води до различна по тежест вродена форма на множествен тропен дефицит (МТД). Характеризира с дефицит или липсата на два или повече хипофизарни хормона, като честотата е от 1:4000 до 1:8000 новородени [5, 6]. При вродената форма на заболяването най-често първо се манифестира дефицитът на РХ или в съчетание с дефицит на TSH [7, 8]. По-късно се изявяват дефицитите на гонадотропни хормони и АКТХ (3-4-та декада на живота). Признаци на заболяването могат да бъдат наблюдавани още при раждането. Симптоми, които насочват към диагнозата, са пролонгиран иктер, директна хипербилирубинемия, епизоди на хипогликемия, крипторхизъм и/или микропенис при момчетата. Изоставането в растежа при хипосоматотропизъм се забелязва от родителите най-често след 3-4-годишна възраст. Това не изключва начало на изоставането още в кърмаческа възраст. Има корелация между степента на изоставането и календарната възраст. Обикновено SDS на ръста надхвърля – 2; линеарният ръст е несъответно нисък спрямо среднородителския ръст, растежната скорост намалява, настъпва децелерация и се сменя растежният канал към по-нисък. При промяна в ТФ, които се включват на по-късен етап от ембриогенезата, обикновено се засяга изолирано хипофизата – размер, архитектоника, хормонална продукция. Късни ТФ са PROP1 и POU1F1. Фенотипна характеристика, която насочва към мутация в гена PROP1, е прогресиращо отпадане на хормоналната продукция на петте хипофизарни клетъчни линии поради хипоплазия на аденохипофизата. Най-честата причина за МТД са мутациите в гена PROP1 (10% от спорадичните случаи и до 50% от фамилните), като най-честата мутация в западна Европа се смята 301-302delAG в екзон 2 на PROP1 [7, 9, 10]. При мутация в гена PU1F1 се наблюдава дефицит на растежен хормон (РХ), тиреостимулиращ хормон (ТСХ) и пролактин, без засягане на другите клетъчни линии, отново асоциирани с хипоплазия на хипофизата [11].

При пациенти с хипопитуитаризъм без екстрапитуитарни аномалии, предизвикани най-често от мутации в гените PROP1 и POU1F1 (около 50%), класическият подход на кандидат-гените е най-бърз и достъпен. Поради вариабилната и прогресивно разгръщаща се клинична картина обаче, този подход показва някои ограничения. Мутации в ранните ТФ (HESX1, SOX2, SOX3, LHX3/4 и др.) предизвикват комплексен фенотип с наличие на екстрапитуитарни аномалии като дефекти в развитието на мозъчни структури, септо-оптична дисплазия, ограничена подвижност на врата, аномалии на слуховия и зрителния анализатор и/или хранопровода, урогениталната система [12, 13, 14].

При пациенти с комплексен фенотип по-достъпен метод е скриниране на целия геном чрез сравнителна геномна хибридизация или секвениране на целия геном. Използването на тези нови методи може да доведе както до откриването на нови патологични региони или гени, участващи в етиологията на МТД с екстрапитуитарни аномалии, така и до разширяване на фенотипната характеристика на познати синдромни заболявания. Изследванията върху честотата и етиологията на хипосоматотропизма в България започват през 1984 г., когато в своя дисертационен труд проф. Пенева установява превалиране на МТД спрямо изолирания дефицит на РХ [15]. За първи път генетични изследвания на български пациенти с МТД са проведени през 2001 г. с изследване на гена PROP1 [16]. През 2011 г. се увеличи броя пациенти, изследвани за PROP1, и се разшири хипофизарният панел с включването на ТФ POU1F1, HESX1, SOX2, SOX3 и гена IGSF1 [17].

С настоящето проучване представяме алгоритъм за подбор на пациенти с хипосомтотропизъм за молекулярно-генетичен анализ въз основа на фенотипната характеристика (фиг. 2).

 

Фиг. 2. Алгоритъм за подбор на кандидати за изследване на определен ген. МТД – множествен тропен дефицит, СОД – септооптична дисплазия, АХ – аденохипофиза, НХ – неврохипофиза.

 

Цел

Изготвяне на алгоритъм за подбор на пациенти с хипосоматотропизъм за молекулярно-генетичен анализ на панел от хипофизарни ТФ: PROP1, POU1F1, HESX1, SOX2, SOX3, IGSF1.

 

Материал и метод

В изследването са включени 108 пациенти (средна възраст 14.5±4.1 год. (x±SD), медиана 12 год.) за периода 2001-2014 г. Изследването е проведено в два етапа (фиг. 3).

Първи етап (2001-2010 г.). Mолекулярно-генетичен анализ на гена PROP1 включва 41 пациенти (средна възраст 11.2 год.), с три задължителни критерия: ДРХ, поне един допълнителен хормонален дефицит и структурни аномалии на хипофизата. Анализът на гена е проведен в 3 стъпки: BcgI рестриктазна реакция, SSCP, директно секвениране по Sanger.

Втори етап (2011-2014 г.). Първа стъпка – разширяване на фенотипа при подбор на пациенти за молекулярно-генетичен анализ на PROP1, като единствен задължителен критерий е ДРХ. Анализът на гена е двустъпален: BcgI рестриктазна реакция и директно секвениране по Sanger. Втора стъпка – разширяване на панела от хипофизарни ТФ: PROP1, POU1F1, HESX1, SOX2, SOX3, IGSF1. Трета стъпка – скрининг на целия геном на пациенти с комплексен фенотип и асоциирани екстрапитуитарни аномалии.

Във втория етап са изследвани 67 пациенти на средна възраст 14±4.0 год., медиана 12 год., от 66 различни семейства, разпределени в групи за молекулярно-генетичен анализ на всеки ген според фенотипната характеристика чрез подхода на кандидат-ген (фиг. 3).

 

 

Фиг. 3. Дизайн на проучването.

 

Резултати

Постави се етиологична диагноза на 11.9% от всички изследвани пациенти.

Първи етап: Доказа се алелна честота на мутации в PROP1 гена 12.2%, като най-честата мутация 150delA (8.5%) се различава от тази в Централна и Западна Европа.

Втори етап: Доказа се алелна честота на мутации в PROP1 гена 8.9%, като отново най-честата мутация бе 150delA в екзон 2 (8%). Откри се висока алелна честота на полиморфизми в различни комбинации в екзон 1: 27C>T (43.9%), 59A>G (90.2%); 109+3G>A (37.8%),  и в екзон 3: 424G>A (19.5%), 425C>T (2.2%), 616T>C (90.2%); *52G>A (1.2%), *120C>T (1.2%), *123T>C (1.2%).

В гените POU1F1, HESX1, SOX2, SOX3 не се откриха мутации и полиморфизми. При един пациент се доказа нова хемизиготна мутация c.2989C>T в IGSF1 гена.  При изследването на двама пациенти с комплексен фенотип, асоцииран в екстрапитутарни аномалии се доказаха:

• 23 микродупликационен синдром, първи пациент със засягане на хипофизата и доказан частичен дефицит на РХ.
• синдром на Koolen-de Vries, първи описан пациент със СОД и нормален интелект.

 

Обсъждане

Хетерогенната етиология и прогресиращата клинична картина на заболяването МТД, както и евентуалната опасност от летален изход изискват продължително проследяване и лечение с мултидисциплинарен подход. Генетичните изследвания и поставянето на точната етиологична диагноза са от ключово значение за ранното диагностициране и лечение на [18]:

• Дефицит на TSH при пациенти с ДРХ и нормална TSH-T4 ос при диагноза;
• ХХ при пациенти в пубертетна възраст;
• Риск от развитие на ACTH дефицит с риск за живота на пациента.
• Диагностициране на екстрапитуитарни аномалии.

Ранната етиологична диагноза е предпоставка за оптимално лечение и за подобряване продължителността и качеството на живот на тези пациенти.

Чрез предложения алгоритъм за подбор на пациенти с хипосоматотропизъм за молекулярно-генетичен анализ въз основа на фенотипната характеристика се постави етиологична диагноза на 11.9% от всички изследвани пациенти. Сред изследваните 108 български пациенти с хипосоматотропизъм се доказа обща алелна честота на PROP1 мутации от 12.5%. Вторият етап на изследването се проведе с разширен фенотип в сравнение с първия. Единственият задължителен критерий бе хипосоматотропизъм. Включени бяха 56 пациенти с МТД или ИДРХ, от 55 различни семейства. При молекулярно-генетичния анализ се доказаха две мутации в PROP1 гена при 5 пациента: 301-302delAG и 150delA. Изчислената алелна честота на PROP1 мутации от 8.9% бе по-ниска от тази в първия етап на проучването с МТД [16]. Българската група пациенти е една от най-големите, като алелната честота е по-ниска от установената в Североизточна и Централна Европа (табл. 1). Липсват PROP1 мутации като етиологична причина в Австралия, Азия и Северна Европа. Съобщаваната честотата на PROP1 мутации е 11-22% в различните проучвания [19-23], а при фамилните форми на МТД може да достигне до 30-50% [2, 9, 10, 24]. Най-висока честота (70%) се съобщава сред пациенти с МТД в Литва [25]. Ниската честота на PROP1 мутации в нашето проучване вероятно се дължи, от една страна, на разширения фенотип, от друга страна – на преобладаването на спорадичните форми (само едно семейство с фамилна форма на МТД).

 

Табл. 1. Разпределение на PROP1 мутациите в света.

Държава	Диагноза	Спорадични/ фамилни	Брой пациенти	Брой пациенти с мутация	% пациенти с мутация	Източник
Литва	МТД	Смесени	67	47	70.2	25
Русия	МТД	Спорадични	14	8	57.1	9
Унгария	МТД		35	15	42.9	6
Португалия	МТД		46	19	41.3	19
Румъния	МТД	Смесени	26	10 (7/3)	38 (100/16)	26
Чехия	МТД		74	18	24.3	18
Турция	МТД	Смесени	76	12	21.8 (58.8/5.3)	27
Турция	МТД	Смесени	53	2	3.8	28
Германия	МТД	Смесени	46	9	19.6	29
България	МТД	Смесени	41	5	12.9	16
България	ИДРХ МТД	Спорадични	56	5	8.9	17
Холандия	МТД	Спорадични	71	0	0	29
Англия	МТД	Смесени	27	0	0	22
Бразилия	МТД	Смесени	77	38	49.4	20
Индия	МТД	Смесени	51			31
Чили	МТД	Спорадични	16	0	0	34
Кореа	МТД	Спорадични	27	0	0	32
Япония	МТД	Спорадични	71	0	0	33
Австралия	МТД	Спорадични	33	0	0	35

 

За молекулярно-генетичен анализ на гена POU1F1  се селектираха 49 пациенти, които отговарят тясно на класическия фенотип (дефицит на РХ, ТСХ и пролактин, хипоплазия на хипофизата). Не се откриха полиморфизми или мутации при изследваните пациенти. Подобни резултати се съобщават и в други проучвания [9, 20, 32, 34]. Мутации в гена, кодиращ POU1F1, са рядка причина за вроден МТД.

В кохортата от пациенти, включени в изследването, се наблюдава преобладаване на мъжкия пол. Поради това Х-свързаният хипопитуитаризъм е взет под внимание и SOX3 е включен в панела от анализирани хипофизарни ТФ. Въпреки придържането към фенотипа, описан при мутации в SOX3 в световната литература, мутации или полиморфизми не се откриха.

Кандидатите за изследване на SOX2 гена са пациенти с доказана ендокринопатия, съчетана с екстрапитуитарно засягане (очни аномалии, СОД, вродена цепка на устната и небцето, атрезия на хранопровода). Не се откриха мутации или полиморфизми в SOX2 гена при селектираните пациенти.

Фенотипно мутациите в HESX1 се асоциират с изключително вариабилен фенотип. Ендокринните дефицити при отделните пациенти варират от ИДРХ до панхипопитуитаризъм. Находката от ЯМР на хипоталамо-хипофизарната област също варира в широки граници [36, 38]. Поради тази причина в изследването бяха включени пациенти както с класическа форма на СОД, така и с хипоплазия на хипофизата, съчетана с вродена цепка на устната и небцето, ектопична хипофиза, синдром на прекъснатия инфундибулум, синдром на empty sella или изолирана хипоплазия на хипофизата. Въпреки разширения фенотип, патологични мутации не бяха доказани. Този резултат корелира с други големи скринингови изследвания, при които мутациите в HESX1 са рядка причина за развитието на СОД. До момента около 1% от пациентите са със СОД имат поставена генетична диагноза [37].

Един от пациентите в изследваната кохорта се отличава с няколко особености: нехармонично пубертетно развитие, характеризиращо се с бързонарастващ тестикуларен обем на фона на нисък серумен тестостерон, превалиране на FSH над LH, късно адренархе с липса на пубично и аксиларно окосмяване; флуктуираща тиреоидна функция; разминаване между нормална спонтанна секреция на РХ и нисък отговор на фармакологична стимулация, на фона на нормален/нисък-нормален IGF1; хипоплазия на аденохипофизата. Въз основа на посочените фенотипни особености, пациента бе насочен към изследване на гена IGSF1. Намерена бе нова хемизиготна мутация (c.2989C<T, p.Arg997*), несъобщавана до момента в литературата. Мутацията предизвиква появата на преждевременен стоп-кодон и синтеза на протеин със скъсен екстрацелуларен домейн. До момента в България не е описан друг пациент с мутация в гена IGSF1. Клинични особености на пациента не са съобщавани до момента при пациенти с мутация в IGSF1 гена. Това обогатява фенотипа на синдрома [39].

Цялостно геномно изследване чрез сравнителна геномна хибридизация е осъществено при двама пациенти. При първия пациент се доказа делеция на 599 kb в хромозома 17:17q21.31, която включва един псевдоген LOC644246 и един ген KANSL1, отговорен за синдрома на Koolen-de Vries. Той се характеризира с неонатална мускулна хипотония, затруднения в храненето, леко до средно изоставане в НПР, умствено изоставане и специфичен лицев дисморфизъм, включващ високо и широко чело, епикантни гънки, широка брадичка, големи или клепнали уши, издължено лице. Изчислената честота на синдрома е 1:16000 живи раждания [40]. До момента са известни поне 60 пациенти от мъжки и женски пол със 17q21.31 микроделеционен синдром. В България има един описан случай на синдром на Koolen de Vries [41]. При изследваната пациентка се наблюдават две особености, които разширяват фенотипната характеристика на синдрома: няма типичното за синдрома умствено изоставане, умственият й потенциал е оценен на по-висок от средния за страната (IQ=112 по Raven) и асоциацията на Koolen de Vries синдром със СОД.

При втория пациент се доказа 7q11.23 микродупликационен синдром. Фенотипът на пациента е комплексен и включва частичен дефицит на растежен хормон на базата на хипоплазия на аденохипофизата, както и наличие на дефект по срединната линия (вродена цепка на небцето и устната), намален слух, мутизъм, очни аномалии [42]. Синдромът се характеризира с дискретни лицеви стигми: коси и близко разположени вежди, дълбоко вложени очи, широка основа на носа, скъсено разстояние между носа и устната, широко изпъкнало чело; асиметрия на лицето и макроцефалия; късно проговаряне; намален слух; леко до средно умствено изоставане; изоставане в НПР; обикновено нормален ръст, но се съобщава за пациенти с изоставане в растежа както пре-, така и постнатално; крипторхизъм; 11% от пациентите – цепка на устната или небцето; поведение от аутистичния спектър; 27% имат офталмологични проблеми, най-често рефракционни аномалии (хиперметропия и астегматизъм), страбизъм и синдром на Дюан. Първият публикуван случай на 7q11.23 микродупликационен синдром е от Somerville et al. през 2005 г. Оттогава досега в света са описани около 50 пациента с тази хромозомна аберация. Съобщаваната честота е 1:12 000 живородени деца. Това е първият съобщен случай на 7q11.23 микродупликационен синдром в България.

 

Заключение

Най-честата причина за МТД при български пациенти е 150delA мутация в PROP1 гена (8.0%). Поради това той е първият кандидат-ген при молекулярно-генетичния анализ на пациенти с ИДРХ и МТД. При момчета с централен хипотиреоидизъм, първи кандидат-ген трябва да бъде IGSF1. Пациенти с комплексен фенотип, включващ ДРХ и екстрапитуитарни аномалии, трябва да се изследват чрез скрининг на целия геном.

 

Библиография

1. Стоева, И. Възможности за молекулярногенетична диагноза при деца с хипосоматотропизъм в България. Практическа педиатрия, 4. 2004. 16.
2. Turton, J.P., Mehta, A., Raza, J. et al. et al. Mutations within the transcription factor PROP1 are rare in a cohort of patients with sporadic combined pituitary hormone deficiency (CPHD). Clin Endocrinol (Oxf), 63. 2005. 1, 10-8
3. Wu, W., JD. Cogan, RW. Pfeaffle, et al. Mutations in PROP1 cause familial combined pituitary hormone deficiency. Nat Genet, 1998, 18: 147-149.
4. Tania M. Ortiga‐Carvalho, Maria I. Chiamolera, et al. Hypothalamus‐Pituitary‐Thyroid Axis. Compr Physiol 2016, 6: 1387-1428
5. Woods, K., M. Cundall, J. Turton, et al. Over- and underdosage of SOX3 is associated with infundibular hypoplasia and hypopituitarism. American Journal of Human Genetics, 76, 2005, 833–849
6. Halás, Z., T. Toke, A. Patócs, et al. High Prevalence of PROP1 Gene Mutations in Hungarian Patients with Childhood-Onset Combined Anterior Pituitary Hormone Deficiency. Endocrine, 30, 2006, 3, 255–260.
7. Kelberman, D., M. Dattani. Hypopituitarism Oddities: Congenital Causes. Horm Res., 68, 2007, suppl 5, 138–144.
8. Pfäffle, R., J. Klammt. Pituitary transcription factors in the aetiology of combined pituitary hormone deficiency. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 25, 2011, 43–60.
9. Fofanova, O., N. Takamura, E. Kinoshita, et al. Compound heterozygous deletion of the PROP-1 gene in children with combined pituitary hormone deficiency. J Clin Endocrinol Metab, 83, 1998, 7, 2601-4.
10. Deladoëy, J., C. Flück, A. Büyükgebiz, et al. “Hot Spot” in the PROP1 Gene Responsible for Combined Pituitary Hormone Deficiency. Clin. Endocrinol. Metab., 84, 1999, 1645-1650.
11. Beck, L., C. Leroy, C. Salau, et al. Identification of a novel function of PiT1 critical for cell proliferation and independent of its phosphate transport activity. J Biol Chem, 2009, 284, 31363–31374.
12. Bakrania, P., Robinson, D. Bunyan et al. SOX2 anophthalmia syndrome: 12 new cases demonstrating broader phenotype and high frequency of large gene deletions. Br J Ophthalmol, 2007, 91, 1471-1476.
13. Carvalho, L., K. Woods, B. Mendonca, et al. A homozygous mutation in HESX1 is associated with evolving hypopituitarism due to impaired repressor-corepressor interaction. Clin. Invest., 112, 2003, 1192–1201.
14. Netchine, I., M. Sobrier, H. Krude et al. Mutations in LHX3 result in a new syndrome revealed by combined pituitary hormone deficiency. Nat Genet., 2, 2000, 25, 182-186.
15. Пенева, Л. Хипосоматотропизъм в детската и юношеската възраст. Дисертация, София, 1984.
16. Stoeva, I., G. Dineva, A. Savov, et al. First results of the PROP-1 mutational screening in Bulgarian patients with combined pituitary hormone deficiency (CPHD). Horm Res., 60, 2003, suppl 2, 66
17. Аройо, А. Множествен тропен дефицит: мутационен скрининг на хипофизарни транскрипционни фактори, корелации генотип-фенотип. Дисертация, София, 2018.
18. Lebl, J., J. Vosa´hlo, R. Pfaeffle et al. Auxological and endocrine phenotype in a population-based cohort of patients with PROP1 gene defects. European Journal of Endocrinology, 153, 2005, 389–396.
19. Lemos MC, Gomes L, Bastos M. et al. PROP1 gene analysis in Portuguese patients with combined pituitary hormone deficiency. Clin Endocrinol (Oxf). 2006, 65, 4:479-85.
20. Viera, T., V. Boldarine, J. Abucham. Molecular Analysis of PROP1, PIT1, HESX1, LHX3, and LHX4 Shows High Frequency of PROP1 Mutations in Patients with Familial Forms of Combined Pituitary Hormone Deficiency. Arq Bras Endocrinol Metab., 51, 2007, 7, 1097-1103.
21. Reynaud, R, M. Gueydan, A. Saveanu, et al. Genetic screening of combined pituitary hormone deficiency: experience in 195 patients. J Clin Endocrinol Metab, 91, 2006, 9, 3329-36.
22. Rainbow, L, SA. Rees, MG. Shaikh, et al. Mutation analysis of POUF-1, PROP-1 and HESX-1 show low frequency of mutations in children with sporadic forms of combined pituitary hormone deficiency and septo-optic dysplasia. Clin Endocrinol (Oxf)., 62, 2005, 163–168.
23. Cruz, J., V. Nunes, S. Clara. Molecular analysis of the PROP1and HESX1 genes in patients with septo-optic dysplasia and/or pituitary hormone deficiency. Arq Bras Endocrinol Metab, 54, 2010, 482-487.
24. Cogan, J., W. Wu, J. Pillips et al. The PROP1 2-Base Pair Deletion Is a Common Cause of Combined Pituitary Hormone Deficiency. J Clin Endocrinol Metab., 1998, 83, 3346–3349.
25. Navardauskaite R., Dusatkova P, Obermannova B., et al. High prevalence of PROP1 defects in Lithuania: phenotypic findings in an ethnically homogenous cohort of patients with multiple pituitary hormone deficiency. J Clin Endocrinol Metab., 2014, 99, 1:299-306.
26. Lazea, C., P. Grigorescu-Sido, R. Popp, et al. The c.301_302delAG PROP1 gene mutation in Romanian patients with multiple pituitary hormone deficiency. J Pediatr Endocrinol Metab., 2015, 28, 9-10, 993-8
27. Baş, F., Z. Uyguner, F. Darendeliler, et al. Molecular analysis of PROP1, POU1F1, LHX3, and HESX1 in Turkish patients with combined pituitary hormone deficiency: a multicenter study. Endocrine, 2015, 49, 2, 479-91
28. Kandemir N, Vurallı D, Taşkıran E., et al. Frequency of mutations in PROP-1 gene in Turkish children with combined pituitary hormone deficiency. Turk J Pediatr. 2012, 54, 6:570-5.
29. Bottner, A., E. Keller, J. Kratzch. PROP1 Mutations Cause Progressive Deterioration of Anterior Pituitary Function including Adrenal Insufficiency: A Longitudinal Analysis. J Clin Endocrinol Metab., 89, 2004, 5256–5265.
30. de Graaff LC, Argente J, Veenma DC., et al. PROP1, HESX1, POU1F1, LHX3 and LHX4 mutation and deletion screening and GH1 P89L and IVS3+1/+2 mutation screening in a Dutch nationwide cohort of patients with combined pituitary hormone deficiency. Horm Res Paediatr. 2010, 73, 5:363-71.
31. Birla S., R. Khadgawat, V. Jyotsna, et al. Identification of Novel PROP1 and POU1F1 Mutations in Patients with Combined Pituitary Hormone Deficiency. Horm Metab Res., 2016, 48, 12, 822-827.
32. Choi J.H., C.W. Jung, E. Kang, et al. Rare Frequency of Mutations in Pituitary Transcription Factor Genes in Combined Pituitary Hormone or Isolated Growth Hormone Deficiencies in Korea. Yonsei Med J., 2017, 58, 3, 527-532.
33. Dateki, S., K. Kosaka, K. Hasegawa, et al. Heterozygous orthodenticle homeobox 2 mutations are associated with variable pituitary phenotype. J. Clin. Endocr. Metab., 95, 2010, 756-764.
34. Lammoglia J., F. Eyzaguirre, N. Unanue et al. Congenital hypopituitarism: report of 23 cases. Rev Med Chil, 136, 2008, 996-1006.
35. McLennan K., Y. Jeske, A. Cotterill, et al. Combined pituitary hormone deficiency in Australian children: clinical and genetic correlates. Clin Endocrinol (Oxf), 2003, 58, 785–794.
36. Dattani, M., J. Martinez-Barbera, P. Thomas, et al. Mutations in the homeobox gene HESX1/Hesx1 associated with septo-optic dysplasia in human and mouse. Nat Genet., 19, 1998, 2, 125-133.
37. Webb, E., M. Dattani. Septo-optic dysplasia. Eur J Hum Genet, 2010, 18, 393–397.
38. Cavallaro, M., Mariani, C. Lancini, et al. Impaired generation of mature neurons by neural stem cells from hypomorphic Sox2 mutants. Development, 135, 2008, 3, 541-547.
39. Wit, JM, W. Oostdijk, M. Losekoot et al. MECHANISMS IN ENDOCRINOLOGY: Novel genetic causes of short stature. Eur J Endocrinol., 174, 2016, 4, 145-73
40. Koolen, D, J. Kramer, K. Neveling, et al. Mutation in the chromatin modifier gene KANSL1 cause the 17q21.31 microdeletion syndrome. Nat, 44, 2012, 639-641.
41. Авджиева, Д., С. Хаджидекова, А. Кадъм и др. Синдром на Koolen de Vries –  21.32 микроделеция. Педиатрия 3. 2014. 55-56.
42. Аройо, А., И. Стоева, Д. Дачева и др. Хипосоматотропизъм, съчетан с вродени аномалии: фенотипно описание на двама пациенти и техните резултати от мутационния транскрипционен скрининг. Педиатрия, LХ, 2015, 2, 26-32.